Aktuelle Entwicklungen

Im Jahr 2025 wurden im Rahmen des Monitorings der Synthetischen Biologie durch Literaturrecherchen in wissenschaftlichen Datenbanken und Suchplattformen insgesamt rund 4950 Treffer identifiziert [1]. Von diesen wurden durch den Arbeitskreis Synthetische Biologie der ZKBS 155 Publikationen für eine genauere Betrachtung ausgewählt. Davon wurden wiederum 24 Publikationen für eine Präsentation in Form von Kurzzusammenfassungen auf der ZKBS-Homepage ausgewählt. Diese bieten einen Überblick in die weltweiten Entwicklungen im Bereich der Synthetischen Biologie. 

Das Monitoring der Originalartikel, die in internationalen Fachzeitschriften mit peer-review veröffentlicht und von der ZKBS als Synthetische Biologie eingestuft wurden, ergab, dass alle beschriebenen Ansätze und Methoden im Rahmen der bestehenden Rechtsvorschriften, insbesondere des GenTG, liegen. 

Im Rahmen des Monitorings ist aufgefallen, dass im Jahr 2025 vermehrt Publikationen zur Generierung von Protozellen bzw. Minimalzellen mittels bottom-up-Ansätzen veröffentlicht wurden. Zudem stieg, wie bereits im Jahr 2024 beobachtet, die Zahl von Veröffentlichungen zu Anwendungen der künstlichen Intelligenz (KI) und zur Laborautomatisierung.

Ferner wurde die ZKBS auf eine Publikation von King et al. (2025) [2] aufmerksam, die als Preprint auf dem bioRxiv-Server veröffentlicht wurde. Da die Arbeit bislang kein peer-review-Verfahren durchlaufen hat, wurde sie nicht als eigenständiger Beitrag in das Monitoring aufgenommen. Ungeachtet dessen stellt diese Publikation aber eine bemerkenswerte Entwicklung im Bereich der Synthetischen Biologie dar. Die Autorinnen und Autoren beschreiben erstmals die Generierung funktioneller Bakteriophagengenome mithilfe eines KI-Modells. Die ZKBS hat sich bereits eingehend mit dieser Arbeit befasst und wird die weitere Entwicklung im Bereich der KI-gestützten de novo Generierung von Nukleinsäureabschnitten und Genomen aufmerksam verfolgen. Darüber hinaus wurde am 19. Juni 2026 zu diesem Themenkomplex ein Kommentar auf der ZKBS-Homepage veröffentlicht: Kommentar der ZKBS zu den Herausforderungen von de novo generierten Nukleinsäureabschnitten und Proteinen bei der Bewertung gentechnischer Arbeiten.

[1] Die Recherche erfolgte in den Datenbanken PubMed und Google Scholar. In PubMed wurden die Suchbegriffe „synthetic biology“, „mirror life“, „mirror image“ und „mirror bacteria“ verwendet. In Google Scholar wurde nach „mirror life“ und „mirror bacteria“ gesucht. 

[2] King et al. (2025) bioRxiv 2025.09.12.675911.

Im Jahr 2024 wählte der Arbeitskreis Synthetische Biologie der ZKBS 225 Publikationen für das Monitoring aus, die anschließend näher betrachtet wurden. Von diesen wurden 28 für eine Präsentation in Form von Kurzzusammenfassungen auf der ZKBS-Homepage ausgewählt. Sie bieten einen Überblick über sowie einen Einblick in die weltweiten Entwicklungen im Bereich der Synthetischen Biologie. 

Die Auswahl der Originalartikel, die in internationalen Fachzeitschriften mit peer-review veröffentlicht wurden und von der ZKBS als Synthetische Biologie eingestuft wurde, ergab, dass alle beschriebenen Ansätze und Methoden im Rahmen der bestehenden Rechtsvorschriften, insbesondere des GenTG, liegen.

Mirror Life

Die ZKBS hat zudem den Kommentar zur Entwicklung von „Spiegelbakterien“ von Adamala et al., der im Dezember 2024 als „Policy Forum“ in Science veröffentlicht und von 38 Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern aus verschiedenen Ländern und Disziplinen verfasst wurde, sowie den dazugehörigen Technischen Bericht zu Spiegelbakterien zur Kenntnis genommen.

Der Kommentar umreißt potenzielle Risiken, die von künstlich erzeugten Spiegelbakterien ausgehen, die aus spiegelbildlichen Aminosäuren, Zuckern usw. bestehen. Nach Ansicht der Autoren ist die technische Realisierung von spiegelbildlichem Leben noch mindestens ein Jahrzehnt entfernt. Sie streben jedoch einen frühzeitigen Dialog mit der wissenschaftlichen Gemeinschaft, politischen Entscheidungsträgern, Forschungsförderern, der Industrie, der Zivilgesellschaft und der Öffentlichkeit an, um mögliche negative Aspekte von Spiegelbakterien zu diskutieren, z. B. eine Immunevasion oder schädliche Auswirkungen auf Ökosysteme. Die Autoren empfehlen, Spiegelorganismen nur dann zu erschaffen, wenn es Beweise gibt, dass Spiegel-Leben keine außergewöhnlichen Gefahren mit sich bringt. Für verwandte Technologien, die zur Herstellung potenzieller therapeutischer Substanzen verwendet werden könnten, empfehlen die Autoren keine Einschränkungen.

Die ZKBS-Arbeitsgruppe Synthetische Biologie hat den Kommentar intensiv diskutiert und hat eine erste Bewertung auf Ihrer Homepage veröffentlicht. Da eine Diskussion zum Thema „Spiegel-Leben“ sowohl in der Wissenschaft als auch der Gesellschaft zu erwarten ist, wird die ZKBS die weltweite Entwicklung von Spiegel-Leben kontinuierlich und aufmerksam verfolgen und auf ihrer Website darüber berichten.

Zwei Highlight Publikationen

Die ZKBS möchte zwei Originalartikel als Highlights der synthetischen Biologie im Jahr 2024 vorstellen.

Zunächst berichteten Chen et al. über den ersten mehrzelligen Organismus mit einem teilweise künstlichen Chromosom. Das Chromosom 18 des Laubmooses Physcomitrium patens wurde chemisch synthetisiert und in seiner Größe deutlich reduziert. Nach dieser Reduktion wuchs das Moos ohne erkennbare phänotypische Auswirkungen. Die Arbeit soll im Rahmen des Projekts zum synthetischen Moosgenom fortgesetzt werden, dessen Ziel es ist, das gesamte Genom durch ein synthetisches zu ersetzen.

Der zweite Artikel, den die ZKBS hervorheben möchte, ist die Arbeit von Gao et al., in der photosynthetische Cyanobakterien, die so modifiziert wurden, dass sie Glukose und ATP sekretieren, als Endosymbionten in Hefezellen eingeführt wurden. Den Hefezellen fehlten die Mitochondrien, sodass sie nur überleben konnten, wenn Glukose und ATP durch die Cyanobakterien bereitgestellt wurde. Diese Chimären wurden stabil gebildet, wuchsen ausschließlich mit CO₂ und Licht und waren in der Lage, unter photosynthetischen Bedingungen natürliche Biosyntheseprodukte zu produzieren.

Für das Jahr 2023 wurden 217 Publikationen durch das Screening identifiziert, die näher betrachtet wurden. 37 davon erscheinen nun als Kurzzusammenfassung auf der ZKBS-Homepage.

Als Highlight-Paper aus dem Jahr 2023 sieht die ZKBS die Arbeiten von Inda-Webb et al., die eine Anwendung generiert haben, die in besonderem Maße biologisches und technisches engineering kombiniert und somit ein Paradebeispiel für eine Anwendung der Synthetischen Biologie darstellt: Die Autoren haben eine Kapsel in der Größe einer Tablette entwickelt, die lebende Bakterien enthält und die eingenommen werden kann, um im Gastrointestinaltrakt Entzündungsmarker zu detektieren. Die gewonnenen Informationen werden direkt an ein Smartphone gesendet. Die Tablette wurde bereits an Schweinen getestet und könnte ein wertvolles diagnostisches Werkzeug werden.

Als weiteres Highlight-Paper möchte die ZKBS die Arbeiten von Belluati et al. hervorheben. Die Autoren haben einen Bioreaktor entwickelt, in dem verschiedene biologische Prozesse ablaufen können. Für die Herstellung des Bioreaktors nutzten die Autoren eine Methode, bei der Myoglobin als Biokatalysator für das Zusammenlagern von synthetischen Polymeren zu GUVs (giant unilamellar vesicles), also künstlichen, zellähnlichen Strukturen, wirkt. Dies stellt einen großen Schritt in Richtung funktioneller künstlicher Zellen dar.

Semantic design of functional de novo genes from a genomic language model (Merchant et al. 2026)

Im Jahr 2024 stellte eine Forschungskollaboration durch die Veröffentlichung von Nguyen et al. das genomische Sprachmodell Evo 1 vor. Es basierte auf Trainingsdaten von 2,7 Millionen Bakterien- und Phagengenomen mit Fokus auf dem Co-Design molekularer Systeme, wie z. B. neuen CRISPR-Cas-Anwendungen. Evo 1 stellte einen Paradigmenwechsel dar, indem es funktionale biologische Systeme direkt auf DNA-Ebene entwarf, anstatt nur Proteinstrukturen zu modellieren. Die Autoren stellen nun die Weiterentwicklung Evo 1.5 vor. Zudem wird SynGenome vorgestellt, eine durch KI hergestellte Genomdatenbank mit 120 Milliarden Basenpaaren synthetischer DNA-Sequenzen, die aus Eingabeaufforderungen (Prompts) mit 9000 Funktionsbegriffen abgeleitet wurden. 

Durch das noch umfangreichere Training mit DNA-Datensätzen erlernt Evo 1.5 die Grammatik und Semantik von Genomen und generiert daraus erfolgreich neuartige Gene mit spezifischen Funktionen. Dazu zählen Gene, die u. a. für Toxin-Antitoxin-Paare kodieren, einschließlich eines Toxins ohne Ähnlichkeit zu bekannten bakteriellen Toxinen sowie funktionale Multi-Komponenten-Systeme wie CRISPR-Cas-Systeme und RNAs. Dies demonstriert die Fähigkeit des Modells zur synthetischen Schöpfung komplexer biologischer Funktionen. So konnte Evo 1.5 zum Beispiel die Regel des Typ-II-Toxin-Antitoxin-Systems erlernen, bei dem das Gen für das Toxin und das Gen für das Antitoxin immer benachbart liegen, auch wenn die Sequenzen von Bakterienart zu Bakterienart stark variieren. Es zeigte sich, dass Evo 1.5 die räumliche Anordnung und Logik von Genen im Genom versteht und Sequenzen generiert, die Proteinpaare kodieren, bei denen in silico-Vorhersagen eine Komplexbildung nahelegen. Die Autoren folgern, dass semantisches Design die Entwicklung der synthetischen Genomik ermöglicht und dabei biologische Erkenntnisse zutage fördern wird, die die bei natürlichen Organismen gemachten Entdeckungen sowohl ergänzen als auch übertreffen werden.

A designer synthetic chromosome fragment functions in moss (Chen et al. 2024)

Die Autoren haben den ersten lebenden mehrzelligen Organismus, das terrestrische Moos Physcomitrium patens, konstruiert, der ein teilweise künstliches Chromosom trägt. Ein Bereich von 155 Kilobasen (kb), der etwa ein Drittel eines Arms des Chromosoms 18 umfasst, wurde durch ein neu gestaltetes, vereinfachtes, chemisch synthetisiertes Fragment von etwa 68 kb ersetzt. Das semi-syn18L Moos zeigt ein normales Wildtyp-Wachstum, produziert Sporen und hält eine dem Wildtyp ähnliche epigenetische Landschaft aufrecht. Chen et al. haben das Genom ohne erkennbare phänotypische Auswirkungen erheblich vereinfacht, was darauf hindeutet, dass viele transponierbare Elemente nur minimale Auswirkungen auf das Wachstum haben. Sie führten auch andere Sequenzmodifikationen ein, wie PCR tags, Genlokus-swapping und Stoppkodon-Substitutionen. Die Ergebnisse legen den Grundstein für das synthetic moss genome project (SynMoss). Die nächste Projekt-Phase legt den Fokus darauf, das gesamte Chromosom 18 durch chemisch synthetisierte Sequenzen zu ersetzen; anschließend soll das gesamte Genom durch ein synthetisches ersetzt werden.

Open-ended molecular recording of sequential cellular events into DNA (Loveless et al., 2025)

Die Autoren stellen den DNA-Recorder peCHYRON (prime editing Cell HistorYRecording by Ordered Nucleotide insertion) vor, der auf ein vorübergehendes biologisches Ereignis hin eine dauerhafte Mutation im Genom einer Zelle inseriert, die später mithilfe von DNA-Sequenzierung rekonstruiert werden kann. Das System verwendet einen prime editor, ein Fusionsprotein aus einer Nickase und einer Cas9-reversen Transkriptase, das spezifische Mutationen einfügt, die über eine prime editing guide RNA (pegRNA) vorgegeben werden. peCHYRON funktioniert wie folgt: eine pegRNA targetiert einen 20 bp-Lokus im Genom einer Zelle und inseriert eine variable 3-nt-Sequenz, die bis zu 6 Bits Information kodiert, zusammen mit einer 17-nt-Propagierungssequenz, die als Zielsequenz für den nächsten Insertionsschritt dient. Nach jeder Insertion liegt die vorherige Propagierungssequenz nicht mehr in direkter Nachbarschaft der PAM-Sequenz und ist somit inaktiv, während die neue Propagierungssequenz neben der PAM-Sequenz liegt und aktiv ist. Jeder Editierungsschritt inseriert eine neue 3-nt-Sequenz mit der neuen Propagierungssequenz als Aufzeichnung eines Ereignisses. Die Insertionen sind aufeinander folgend und können unendlich oft wiederholt werden. Dadurch wird eine zeitlich aufgelöste Aufzeichnung mehrerer zellulärer Signale in Säugetierzellen möglich. Die Autoren zeigten, dass die konstitutive Expression von pegRNA-Sammlungen Insertionsmuster für die direkte Rekonstruktion von Zelllinienbeziehungen erzeugt, während die induzierbare Expression spezifischer pegRNAs zu einer genauen Aufzeichnung der Exposition gegenüber bestimmten biologischen Stimuli führt.

Convenient synthesis and delivery of a megabase-scale designer accessory chromosome empower biosynthetic capacity (Ma et al. 2024)

Komplexe Merkmale, die auf umfangreichen genetischen Informationen beruhen, in neuen Wirten zu rekonstruieren, ist weiterhin herausfordernd. In ihrer Arbeit entwickelten Ma et al. eine CRISPR/Cas9-vermittelte Haploidisierungsmethode, die den natürlichen Prozess der Meiose umgeht. Basierend auf der programmierten Haploidisierung in Hefe entwickelten sie eine Methode namens HAnDy (Haploidization-based DNA Assembly and Delivery in yeast), die eine effiziente Assemblierung und Übertragung großer synthetischer DNA-Fragmente ermöglicht, ohne dass aufwendige in vitro-Manipulationen erforderlich sind. Mit HAnDy wurde ein de novo entworfenes 1024 Mb großes synthetisches akzessorisches Chromosom (synAC), das 542 exogene Gene kodiert, parallel assembliert und dann direkt auf sechs phylogenetisch unterschiedliche Hefen übertragen. Das synAC fördert die Anpassung des Wirts und erweitert den Umfang des Stoffwechselnetzwerks, was die Produktion von nützlichen Stoffen ermöglicht. Es wird erwartet, dass mithilfe dieses Ansatzes zukünftig große DNA-Fragmente assembliert und übertragen werden können, um komplexe biologische Funktionen zu erweitern und zu entziffern. 

Building synthetic chromosomes from natural DNA (Coradini et al. 2023)
Die Autoren berichten über die Methode CReATiNG (Cloning, Reprogramming, and Assembling Tiled Natural Genomic DNA) zur Konstruktion synthetischer Chromosomen aus geklonten Segmen-ten natürlicher DNA aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die neue Methode ist eine schnellere und kostengünstigere Alternative zur de novo-Chromosomensynthese und könnte in der Forschung eingesetzt werden, wenn keine vollständige Chromosomenreprogrammierung erforderlich ist. Im Wesentlichen werden natürliche Chromosomensegmente so kloniert, dass spezifische Adapterse-quenzen an ihre Enden angehängt werden, die vorgeben, wie diese Moleküle später miteinander kombinieren, wenn sie zusammengesetzt werden. Anschließend werden die klonierten Segmente gemeinsam in Zellen übertragen und durch homologe Rekombination zusammengesetzt. Die Me-thode wurde verwendet, um Chromosomen zwischen verschiedenen Stämmen und Arten synthe-tisch zu rekombinieren, die Chromosomenstruktur zu modifizieren und viele verknüpfte, nicht be-nachbarte Regionen, die 39 % eines Chromosoms ausmachen, zu deletieren. Das Multiplex-Deletionsexperiment zeigt, dass CReATiNG auch die Korrektur von Fehlern im synthetischen Chro-mosomendesign durch Rekombination zwischen einem synthetischen Chromosom und seinem nati-ven Gegenstück ermöglicht.

Continuous synthesis of E. coli genome sections and Mb-scale human DNA assembly (Zürcher et al. 2023)
Die Autoren haben das Tool BASIS, Bacterial artificial chromosome (BAC) Stepwise Insertion Synthesis, eine Methode, mit der DNA im Megabasen-Bereich in Escherichia coli-Episomen zusammengefügt werden kann, entwickelt. Die Autoren nutzten BASIS, um 1,1 Mb menschlicher DNA zusammenzusetzen. BASIS bietet eine leistungsstarke Plattform für den Aufbau synthetischer Genome verschiedener Organismen. Sie entwickelten außerdem die Methode CGS (Continuous Genome Synthesis), die sich für den kontinuierlichen Austausch sequenzieller 100-kb-Abschnitte des Genoms von E. coli durch synthetische DNA eignet. CGS minimiert Überkreuzungen zwischen der synthetischen DNA und dem Genom derart, dass das Genom-Produkt eines 100 kb Austausches ohne Sequenzierung als Ausgangsmaterial für den nächsten 100 kb Austausch verwendet werden kann. Innerhalb von 10 Tagen wurde in fünf Runden (und damit aus 5 Episomen) ein 0,5-Mb-Abschnitt des Genoms von E. coli synthetisiert, welches ein Schlüsselelement im Gesamtgenom darstellt. Durch parallele Anwendung von CGS in Kombination mit einer schnellen Oligonukleotidsynthese und Episomenmontage sowie schnellen Methoden zur Zusammenstellung eines einzelnen Genoms aus Stämmen mit verschiedenen synthetischen Genomabschnitten gehen die Autoren davon aus, dass es möglich sein wird, ganze E. coli Genome mit funktionalem Design in weniger als zwei Monaten zu synthetisieren.

Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0)
In diesem Projekt arbeitet ein globales Konsortium daran, das erste synthetische Eukaryoten-Genom mit spezifischen molekularen Markierungen von Grund auf neu herzustellen. Das Ziel des Projekts besteht darin, einen vollständig synthetischen Hefeorganismus zusammenzusetzen und die Forschung im Bereich der synthetisch-technischen Biologie bei Eukaryoten zu erleichtern. Stand 2023: Insgesamt wurden 14 Sc2.0-Chromosomen plus einem zusätzlichen tRNA-Neochromosom erzeugt, zudem sollen zwei weitere Chromosomen sollen hergestellt werden. Hier finden Sie allgemeine Informationen und den aktuellen Stand des Sc2.0-Projekts. In einer Reihe von Veröffentlichungen, die sich einzelnen synthetischen Chromosomen widmen, beschreibt das Sc2.0-Konsortium neue Erkenntnisse über Aneuploidie, extrachromosomale DNA-Regulation, Chromosomenfusion und viele andere Aspekte der Hefegenombiologie (Blount et al., Foo et al., Lauer et al., Shen et al., Williams et al., Luo et al.). Zu den Höhepunkten gehört die Schaffung eines Hefestamms, der sieben synthetische Chromosomen enthält, was etwa 50 % des Hefegenoms entspricht, und der ähnlich wie Wildtyp-Hefe funktioniert (Zhao et al. 2023), die Schaffung eines Stamms, dessen gesamte tRNA-Gene auf ein vollständig synthetisches tRNA-Neochromosom verlagert wurden (Schindler et al. 2023) sowie die Neugestaltung und 3D-strukturelle genomische Charakterisierung des größten Hefechromosoms (Zhang et al. 2023).

In diesem Themenbereich wurde 2022 nur eine Publikation ausgewählt, in der eine simultane Rekodierung des TAG-Stoppkodons gezeigt wird. Mithilfe informatischer und molekularbiologischer Methoden konnten in einer humanen Zelllinie 33 TAG-Stoppkodons gleichzeitig in die Sequenz TAA umgeändert werden (Chen et al. 2022).

Image cell lineage with a synthetic recording system (Chow et al. 2021) Die Autoren entwickelten eine Methode, um die Abstammung einer Zelle in situ mit Hilfe eines bildgebenden readout aufzuzeichnen. Für ihr "integrase-editable memory by engineered mutagenesis with optical in situ readout (intMEMOIR)"-System verwendeten sie ortsspezifische Serin-Integrasen wie Bxb1. Dazu wurden die Zellen mit einem Barcode versehen, der von attP- und attB-sites flankiert ist. Diese sites ermöglichen eine Bxb1-spezifische Rekombination, die entweder zu einer Deletion oder einer Inversion des Barcodes führt. Der Zustand der Zellen kann mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ausgelesen werden. In einem Organismus können zehn orthogonale attP- und attB-sites verwendet werden, was die Aufzeichnung von 310 Zuständen ermöglicht. Um das System in vivo zu testen, haben die Autoren die Drosophila-Linie memoiphila hergestellt, die 10 Barcodes trägt und deren neuronale Zellen durch Hitzeschocks Integrase-editiert werden können. Die Editierung wurde vier Stunden nach der Eiablage eingeleitet, so dass die mit bestimmten Arrays markierten Neuroblasten ihre Editierung an alle Nachkommenzellen im erwachsenen Gehirn weitergeben können. Die erwachsenen Fliegen wurden anschließend seziert und ihre Gehirne in mehreren Runden einer FISH-Analyse unterzogen, bei der die induzierten Veränderungen sowie die Expression von acht endogenen Genen, die verschiedene neuronale Zelltypen markieren, ausgelesen wurden. Durch die Kombination von Genexpression und Zellklonen, die durch Barcode-Editierung identifiziert wurden, konnten mehrere bekannte Zelltypen bestimmt werden. Die Möglichkeit, die Abstammung einer Zelle direkt im nativen Gewebe sichtbar zu machen, könnte Aufschluss über die Rolle verschiedener Faktoren bei der Differenzierung von Zellen geben.

Belcher et al. (2020) haben Bibliotheken von synthetischen Promotoren und korrespondierenden Transkriptionsfaktoren (TFs) für Pflanzen erstellt. Mithilfe der TFs soll eine präzisere Expression von Transgenen möglich werden und Pflanzen so leichter verändert werden können. Die Autoren begannen mit einem pflanzlichen Minimalpromotor, dem sie verschiedene verknüpfte cis-Elemente aus dem gut charakterisierten Hefe-GAL4-Regulon hinzufügten. Diese cis-Elemente werden durch den GAL4 TF gebunden. Die Promotoren mit den cis-Elementen zeigten unterschiedliche Expressionsstärken, die zur Feinregulierung der Genexpression genutzt werden können. 25 solcher Promotoren wurden in vivo erfolgreich in Arabidopsis thaliana getestet. Die Anzahl von TF wurde dann auf TFs aus anderen Familien und deren jeweilige cis-Elemente erweitert. Schließlich wurden der Promotor-Bibliothek Transaktivatoren und Repressoren hinzugefügt, indem bekannte Transaktivierungsdomänen aus Zea mays oder dem Herpes-Simplex-Virus Typ 1 oder die Repressordomäne SRDX mit den TFs oder verkürzten Versionen davon, die nur aus der DNA-Bindungsdomäne bestanden, fusioniert wurden. Die hier entwickelten hybriden Promotoren binden unterschiedliche TFs, die wiederum an verschiedene Aktivator- oder Repressor-Domänen gekoppelt sind. Dadurch können in Pflanzenzellen „Rechenoperationen“ mit multiplen Logikgattern ausgeführt werden. - zur Originalliteratur

Kotopka et al. (2020) etablierten ein in silico-basiertes Verfahren, um artifizielle Promotoren für Saccharomyces cerevisiae zu generieren. Um die Datengrundlage für dieses Modell zu generieren, wurden konservierte Motive von bekannten Promotoren in Kombination mit randomisierten spacer-Sequenzen verwendet, um zwei plasmidbasierte Bibliotheken in S. cerevisiae zu erstellen. Diese Bibliotheken umfassen über 675.000 konstitutive und über 327.000 durch einen künstlichen Transkriptionsfaktor (ZEV) induzierbare Promotoren. Die Bibliotheken wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung in Kombination mit Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (FACS-seq) analysiert. Im nächsten Schritt wurde ein in silico-Modell erstellt, das die Promotoraktivität als Funktion der Sequenz vorhersagt. Durch die Implementierung eines convolutional neural network (CNN) als deep-learning-Technik konnte das Modell die sehr großen Datenmengen verarbeiten. Um die mit diesem Modell getroffenen Vorhersagen zu validieren, wurden in silico-Sätze künstlicher Promotoren mit drei verschiedenen Sequenzdesigns erzeugt: 1) Screening: Generierung randomisierter Sequenzen basierend auf den Original-Bibliotheken, 2) Evolution: Mutagenese spezifischer Sequenzen und 3) gradient ascent: wiederholte Modifizierung initial randomisierter Sequenzen. Des Weiteren wurde bei der Promotoraktivitätsvorhersage eine GC-Einschränkung implementiert. Diese Sätze künstlicher Promotoren wurden im Vergleich mit Kontrollpromotorsätzen anschließend mittels Transformation in Hefe und FACS-seq-Analysen getestet. Dabei zeigte sich, dass die Screening- und Evolutionsdesign-Promotoren eine ähnlich hohe Diversität wie die stärksten Promotoren aus dem initial generierten Datensatz hervorbrachten. BeiF Promotoren, welche mit dem gradient ascent-Ansatz generiert wurden, war dies nicht der Fall. Diese verloren an Diversität. Weitergehende Optimierungen beim Evolutions- bzw. gradient ascent-Design führten letztlich zu expressionsstarken Promotorsequenzen, selbst wenn eine GC-Einschränkung implementiert wurde. Dieses Modell kann nicht nur verwendet werden, um Sequenzen mit nützlichen und seltenen Eigenschaften zu erzeugen, sondern auch, um große und sequenzvielfaltige Sätze von Promotoren mit hoher Aktivität zu generieren. - zur Originalliteratur

Lin et al. (2020) etablierten ein Einzelstrang-Doppelstrang-(ss-ds-)DNA-Gerüst für eine DNA-basierte, dynamisch operierendende und wiederverwendbare Datenspeicherung (DORIS). Systeme, welche DNA-basierte Datenspeicher nutzen, sollten drei grundlegende Kriterien erfüllen: 1) Skalierbarkeit, 2) Kompatibilität mit effizienter und dichter Kodierung und 3) Wiederverwendbarkeit. Um diese Kriterien zu erfüllen, wurde Doppelstrang-(ds-)DNA mit einem Einzelstrang-Überhang (ss-dsDNA) per PCR hergestellt. Dem Einzelstrang („file address“, 20 nt) folgte ein dsDNA-Anteil mit dem T7-Promotor (23 nt) und den kodierten Daten (data payload, 117 nt). Dabei sieht das Design die gleiche „file address“ für alle DNA-Stränge vor, die für eine bestimmte Datei kodieren. Dies ermöglicht es, die file-relevanten Stränge mittels magnetgekoppelter komplementärer Oligonukleotide aus einem Pool gemischter DNA-Moleküle bei Raumtemperatur zu separieren. Anders als bei PCR-basierten Separationsmethoden wird der data payload-Abschnitt nicht aufgeschmolzen, wodurch das Binden der Oligonukleotide an eventuelle ähnliche Sequenzen im data payload verhindert wird. Dies ermöglicht einen höheren Spielraum in der Gestaltung des data payload und erhöht somit die Informationsdichte (Information pro nt) und die Kapazität (Maximalspeicherung des Systems). Um als Datenspeicher fungieren zu können, wurde DORIS so konzipiert, dass auch während der Speicherung Änderungen wie das Sperren und Entsperren von Daten, die Änderung der Dateinamen oder das Löschen von Daten möglich sind. Dies wurde beispielhaft für die Datensperrung demonstriert, indem bei hohen Temperaturen (98°C) ein 20 nt langes, zur "file address" komplementäres Oligonukleotid an die ss-dsDNA angelagert wurde und diese somit verschlüsselte. Um das System zu entsperren, wurde ein „Schlüssel“-Oligo verwendet, welches komplementär zum „Sperr“-Oligonukleotid ist. Die Änderung der Dateinamen erfolgte ebenfalls über ein Oligonukleotid, in dem die neue „file address“ und die alte „file address“ in einer zusammengesetzten Sequenz vorliegen, wodurch letztlich eine neue Einzelstrang-Überhangsequenz erstellt wird. Das Löschen von Daten aus dem Speicher erfolgte durch Oligonukleotide, welche die „file address“ blockieren. Die erhöhte Informationsdichte und Kapazität des Systems, kombiniert mit der Möglichkeit, während der Speicherung der Daten Modifikationen vorzunehmen, stellt einen ersten Schritt in Richtung DNA-basierter paralleler Verarbeitung von extrem hohen Informationsmengen (z. B. medizinische, genombasierte und Finanzdaten) dar. - zur Originalliteratur

Fredens et al. (2019) synthetisierten das bisher größte artifizielle Genom, ein Escherichia coli-Genom mit einer Größe von 4 Mbp. Dazu wurde mithilfe der REXER (replicon excision for enhanced genome engineering through programmed recombination)-Technik das Gesamtgenom von E. coli MDS42 durch ein synthetisches Genom ersetzt. Für das synthetische Genom wurden in den proteinkodierenden Genen nur 61 der 64 möglichen DNA-Kodons verwendet. Zwei Kodons für Serin (TCG und TCA) und ein Stopp-Kodon (TAG) wurden durch synonyme Kodons ersetzt, sodass insgesamt 18.214 Kodons geändert wurden. - zur Originalliteratur

Wang et al. (2019) entwickelten und erprobten ein System zur präzisen Aufteilung des unmodifizierten Genoms von E. coli auf definierte, zirkularisierte artifizielle Chromosomen. Dabei erfolgte die Aufteilung des E. coli-Genoms in der Zelle mittels Cas9, dem lambda-Red-Rekombinationssystem und einem artifiziellen bakteriellen Chromosom (BAC), welches als Akzeptor für einen Teil des Genoms fungiert. So entstand ein reduziertes Genom-Chromosom und ein BAC-Chromosom mit dem Restgenom. Die Aufteilung des Genoms hatte nur einen geringen Einfluss auf das Wachstumsverhalten der Zellen und blieb generationsübergreifend stabil. Zusätzliche Modifikationen des Systems erlaubten es, gezielte Inversionen bzw. Translokationen im getrennten Genom vorzunehmen und definierte Abschnitte von Genomen unterschiedlicher E. coli-Stämme miteinander zu kombinieren. Im Ergebnis wurde ein System geschaffen, dass ein schnelles und präzises engineering von großen Genomen ermöglicht. - zur Originalliteratur

Quantum spin resonance in engineered proteins for multimodal sensing (Abrahams et al. 2026)

Die Autoren haben magneto-sensitive fluoreszierende Proteine (MFPs) entwickelt, also Proteine, deren Fluoreszenz sich in Abhängigkeit von einem äußeren Magnetfeld verändert. Die Proteine sind von einer LOV2 (light-oxygen-voltage)-Domäne abgeleitet, einem natürlichen Lichtsensor, der ursprünglich aus Pflanzen stammt und dafür sorgt, dass sich die Pflanze zum Licht hin orientiert. MFPs fungieren als Quantensensoren, indem sie erlauben, Magnetfelder und freie Radikale direkt im Inneren einer einzelnen lebenden Zelle über ein verändertes Fluoreszenzsignal sichtbar zu machen. Diese Funktion beruht dabei auf Prozessen, die von Elektronenspin- oder Kernspin-Effekten abhängen, das heißt vom Eigendrehimpuls eines Elektrons oder dem Gesamtdrehimpuls eines Atomkerns. Das Signal, also die optisch detektierte magnetische Resonanz (ODMR), entsteht vermutlich durch ein Zusammenspiel der LOV2-Domäne mit einem Flavin-Cofaktor-Chromophor (ein Vitamin-Molekül, das Licht aufnimmt). Konkret teilen sich die LOV2-abgeleitete Domäne und das Chromophor zwei Elektronen. Die Verbindung der zwei Elektronen wird als Radikal-Paar bezeichnet. Die beiden Elektronen drehen sich wie winzige Kompasse (spin) und, da sie miteinander verbunden sind, beeinflussen sie sich gegenseitig (sie sind spin-korreliert). Ein Magnetfeld von außen stört diese Drehung. Dadurch ändert sich das Leuchten des Fluoreszenzproteins, was mit einem einfachen Fluoreszenzmikroskop verfolgt werden kann. Die MFPs wurden durch gerichtete Evolution gezielt verbessert. Durch das Zusammenbringen verschiedener MFP-Varianten können mehrere biologische Prozesse gleichzeitig gemessen werden. Die Methode funktioniert in dreidimensionalen Räumen, sodass beispielsweise genau bestimmt werden kann, wo ein Signal in einer Zelle lokalisiert ist und ob sich freie Radikale in der Zelle befinden. MFPs können somit als biologische Sensoren dienen, indem sie per Lichtsignal die Änderung des Magnetfelds melden, oder als biologische Schalter, wobei man durch Veränderung des Magnetfelds gezielte Reaktionen in der Zelle auslöst. 

Programmable trans-splicing riboregulators for complex cellular logic computation (Gao et al. 2025) 

Die Autoren entwickelten eine neuartige Klasse von Riboregulatoren, die sogenannten split-intron-enabled trans-splicing riboregulators (SENTRs). Riboregulatoren sind RNA-Moleküle, die wie molekulare Schalter die Genexpression in Zellen steuern. SENTRs nutzen die katalytische Aktivität von Gruppe-I-Introns, um getrennt exprimierte RNA-Fragmente durch trans-Spleißen wieder zu einer funktionellen RNA zusammenzufügen. Als Grundlage diente das Gruppe-I-Intron von Tetrahymena thermophila (TT-Intron), das in zwei Hälften aufgeteilt wurde. Diese wurden mit synthetischen external guide sequences (EGSs) versehen, die die Zusammenlagerung der RNA-Fragmente fördern und dadurch die trans-Spleiß-Reaktion auslösen. 

Die Funktionalität der SENTRs wurde mithilfe eines Fluoreszenz-Assays gemessen, bei dem das gespaltene Intron in das sfgfp (superfolder GFP)-Gen eingefügt wurde. Dafür wurde eine Bibliothek aus 56 EGSs erzeugt und getestet. Die zwei leistungsstärksten Varianten erreichten eine ca. 10.000-fache Aktivierung und zeichneten sich durch eine sehr geringe Hintergrundaktivität aus. Zur Verbesserung der Vorhersagbarkeit analysierten die Autoren zahlreiche EGS-Kombinationen und nutzten die gewonnenen Daten zum Training von Machine-Learning-Modellen. Zudem wurden orthogonale SENTRs entwickelt, die weitgehend unabhängig voneinander funktionieren und sich daher für komplexe genetische Schaltkreise eignen. 

Die Autoren zeigten außerdem, dass SENTRs flexibel an verschiedenen Positionen innerhalb von Genen eingesetzt werden können. Darüber hinaus wurden sie zur Regulation eines CRISPR-Aktivierungssystems verwendet und zu RNA-Sensoren weiterentwickelt, die spezifische intrazelluläre mRNAs erkennen können. SENTRs wurden auch verwendet, um biologische Schaltkreise zu konstruieren. Mithilfe von SENTRs wurden verschiedene Zwei-Eingangs-Logikgatter (AND, NAND, OR, NOR, IMPLY und NIMPLY) sowie komplexere Drei- und Vier-Eingangs-Systeme realisiert, die beispielsweise die Expression eines Fluoreszenzproteins steuern. Durch die Kombination mit Split-Intein-vermitteltem Protein-trans-Spleißen (Pinto et al. 2020) konnten auch Sechs-Eingangs-Schaltungen aufgebaut werden. SENTRs sind in verschiedenen Organismen einsetzbar, darunter Bakterien-, Hefe- und Säugerzellen, und stellen somit ein vielseitiges Werkzeug auf posttranskriptioneller Ebene dar.

Electromagnetic wireless remote control of mammalian transgene expression (Lin et al. 2025)

Die Autoren entwickelten ein drahtlos steuerbares elektronisches System für minimalinvasive biomedizinische Anwendungen, das durch ein elektromagnetisches Feld aktiviert wird. Dafür kombinierten sie spezielle Nanopartikel mit gentechnisch veränderten Zellen. Die Nanopartikel reagieren auf das elektromagnetische Feld und erzeugen dabei reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Diese dienen als Signal, um die Zellen zu aktivieren. 

Die verwendeten Zellen sind so verändert, dass sie auf ROS reagieren. Dabei wird ein zellulärer Signalweg aktiviert, bei dem das ROS-sensitive Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1) den Transkriptionsfaktor nuclear factor erythroid 2 p45-related factor 2 (NRF2) freisetzt. NRF2 bindet anschließend an synthetische antioxidant-response-elements (AREs) in Promotorregionen und startet dadurch die Genexpression von Zielgenen.

Das System wurde zur Kontrolle des Blutzuckerspiegels bei Mäusen mit Typ-1-Diabetes validiert. Die gentechnisch veränderten Zellen wurden gemeinsam mit den Nanopartikeln in Alginat-Mikrokapseln eingeschlossen, um sie vor dem Immunsystem des Wirts zu schützen. Nach Exposition gegenüber einem elektromagnetischen Feld produzierten die Zellen Insulin als therapeutisches Zielprotein, wodurch der Blutzuckerspiegel der Mäuse sank.

Engineering yeast multicellular behaviors via synthetic adhesion and contact signaling (Meng et al. 2025)

Die Autoren entwickelten ein Baukastensystem, das eine Kontakt-abhängige Kommunikation von Zellen sowie eine spezifische Zell-Zell-Adhäsion in Hefezellverbänden ermöglicht. Die Kontakt-abhängige Kommunikation wird durch auf der Zelloberfläche präsentierte Peptide und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) vermittelt und als mating-peptide anchored response system (MARS) bezeichnet. Die Zell-Zell-Adhäsion wird durch Paare komplementärer Adhäsionsproteine vermittelt und als SATURN (Saccharomyces Adhesion Toolkit for mUlticellular patteRNing) bezeichnet. Beide Systeme ahmen das Prinzip der juxtakrinen Signalübertragung nach, bei der eine direkte Zell-Zell-Kontaktaufnahme erforderlich ist. Durch die Kombination beider Systeme wurden multizelluläre logische Schaltkreise entwickelt. Darüber hinaus wurde ein genetischer Sensor zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen sowie zur Selektion hochaffiner Nanobody-Binder (kleine künstliche stark bindende Antikörper) entwickelt.

Für MARS wurden sogenannte Display- und Sensorzellen hergestellt, die jeweils ein Signalpeptid beziehungsweise einen GPCR auf ihrer Oberfläche präsentieren. Um natürliche Zell-Zell-Adhäsion zu verhindern, wurde der dafür verwendete Hefestamm durch knockout von 17 Genen modifiziert. Erkennt der auf einer Sensorzelle exprimierte GPCR das membrangebundene Signalpeptid einer benachbarten Displayzelle, wird eine Phosphorylierungskaskade ausgelöst, die schließlich zur Expression eines Fluoreszenzproteins führt. Insgesamt wurden acht orthogonale MARS-Paare entwickelt. Eine multizelluläre Logikkette auf Basis von MARS wurde erstellt, bei der eine Display-Zelle eine Sensorzelle aktiviert, die daraufhin ein neues MARS-Peptid exprimiert und präsentiert. Die Signalübertragung konnte über Ketten von bis zu sechs sequenziell verbundenen Zellen nachgewiesen werden. Zusätzlich konnten logische Operationen wie OR-, NOT- und AND-Gatter implementiert werden.

Für SATURN wurden hochaffine Proteinpaare, beispielsweise das SpyTag–SpyCatcher-System, auf unterschiedlichen Hefezellpopulationen präsentiert. Die zugrunde liegenden Hefestämme basierten auf den MARS-Zellen und wurden zusätzlich durch sechs weitere CRISPR-vermittelte Gen-Deletionen modifiziert, um verbliebene Adhäsionsproteine einschließlich der FLO-Gene (Gene, die Proteine zur Ausflockung sowie Adhäsine kodieren) zu entfernen. Insgesamt wurden acht orthogonale Adhäsionspaare identifiziert. 

Anschließend wurden SATURN und MARS kombiniert, sodass Hefezellen zunächst über SATURN miteinander interagierten und anschließend über MARS-Signale eine veränderte Genexpression auslösten. Die beiden Systeme wurden außerdem kombiniert, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Hierbei wurde die Bindungsstärke zweier Zielproteine mit einer intrazellulären Genexpression gekoppelt. Dabei präsentieren Display- und Sensorzellen zusätzlich zu Signalpeptid bzw. GPCR jeweils ein Protein von Interesse auf ihrer Oberfläche. Das System wurde erfolgreich zur Untersuchung und Selektion von Antigen-Nanobody-Interaktionen eingesetzt. 

Alle Systeme können zukünftig verwendet werden, um maßgeschneiderte multizelluläre Hefesysteme zu konstruieren.

Engineered receptors for soluble cellular communication and disease sensing (Piraner et al. 2024)

Die Autoren modifizierten den sogenannten synthetischen Intramembran-Proteolyse-Rezeptor (SNIPR) (Zhu et al. 2022), einen Rezeptor, der nicht nur durch membrangebundene, sondern auch durch lösliche Liganden aktiviert werden kann. SNIPR verwendet Domänen der regulierten Intramembran-Proteolyseproteine Notch und Robo1, die an eine Ligandenbindungsdomäne, wie ein Antikörperfragment (single-chain variable fragment) oder einen nanobody, und einen Transkriptionsfaktor gekoppelt sind, der aktiviert wird, wenn ein Ligand gebunden ist. Er bindet natürliche und synthetische lösliche Faktoren. Es wurde gezeigt, dass SNIPR chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen zu soliden Tumoren lotsen kann, die lösliche krankheitsassoziierte Faktoren exprimieren. Darüber hinaus entwickelten die Autoren orthogonale synthetische Signalnetzwerke für zelluläre Kommunikation und Umweltinteraktionen. SNIPR könnten in Zellen für therapeutische Zwecke oder zur Untersuchung biologischer Interaktionen eingesetzt werden.

Synthetic protein circuits for programmable control of mammalian cell death (Xia et al. 2024)

Die Autoren haben einen genetischen Schaltkreis erstellt, der den Zelltod von Säugerzellen auslöst. Zellen können den Zelltod u. a. entweder über Apoptose oder Pyroptose herbeiführen. Während die Apoptose keine Immunantwort auslöst, führt die Pyroptose zur Freisetzung von Schaden-assoziierten molekularen Mustern, die eine Immunstimulation und Entzündung hervorrufen. Der sogenannte Synpoptose-Schaltkreis wurde mit modifizierten Apoptose- (Caspase-3) und Pyroptose- (Gasdermin) induzierenden Proteinen aufgebaut. Beide Proteine wurden für eine Protease-gesteuerte Expression/Repression modifiziert und zeigten die gewünschte Wirkung in verschiedenen Zelltypen. Der Synpoptose-Schaltkreis wurde auch so modifiziert, dass er selektiv bestimmte Zielzellen erkennen und eliminieren oder als Werkzeug für die Herstellung synthetischer Killerzellen dienen kann. Dazu wurden Senderzellen so verändert, dass sie virusähnliche Partikel exprimieren, die Synpoptose-Schaltkreise enthalten, um in Empfängerzellen einzudringen und diese zu eliminieren. Der Synpoptose-Schaltkreis ist somit ein Schritt hin zur programmierbaren Kontrolle des Zelltods bei Säugetieren, und kann in der Zukunft z. B. zur Behandlung von Krebs, Autoimmunerkrankungen oder Infektionen genutzt werden.

Programmable mammalian translational modulators by CRISPR-associated proteins (Kawasaki et al. 2023) Die Autoren funktionierten Cas-Proteine als Translationsmodulatoren in Säugetierzellen um, um künstliche Logikschaltungen zu bauen. Ein Cas-Bindungsmotiv wurde in die 5'-untranslatierte Region eines Zielgens eingeführt. Wenn das jeweilige Cas-Protein in derselben Zelle vorhanden war, wurde die Translation des Zielgens durch die Bindung von Cas an das in der mRNA vorhandene Bindungsmotiv unterdrückt. Die Autoren konstruierten auch einen Anschalter, bei dem die Bindung des Cas-Proteins den Abbau der mRNA durch Nonsense-mediated decay verhindert. Durch die Verwendung eines split-Cas9-Proteins wurden zudem genetische Logikgatter (NAND) konstruiert.

Engineered bacterial swarm patterns as spatial records of environmental inputs (Doshi et al. 2023) Die Autoren haben Proteus mirabilis, ein Bakterium, das natürlicherweise auf festem Agar zentimetergroße Bullaugen-Schwarmmuster bildet, so verändert, dass es auf bestimmte Umweltreize reagiert und charakteristische Schwarmmuster bildet. Diese Schwarmmuster dienen als visuelle Darstellung von Umweltbedingungen und ermöglichen es, komplexe Umweltinformationen auf einfache Weise zu erfassen und zu visualisieren. Insbesondere wurde ein Stamm von P. mirabilis entwickelt, der das Vorhandensein von bis zu 50 mM Kupfer in Wasserproben visuell aufzeichnete, wobei sich die Ringbreiten und Kolonieradien an den Messpunkten stufenweise von 0 mM bis 50 mM veränderten. Diese Arbeit bietet einen Ansatz für die Konstruktion von bakteriellen Aufzeichnungsgeräten im Makromaßstab.

Tailored Synthetic sRNAs Dynamically Tune Multilayer Genetic Circuits (Velazquez Sanchez et al. 2023) Die Autoren haben neuartige kleine RNAs (sRNAs) entwickelt, die die Genexpression von genetischen Schaltkreisen mit einem breiten Repressionsspektrum (hoch, mittel und niedrig) dynamisch modulieren, indem sie den intrinsischen RNA-Interferenzweg in Escherichia coli nutzen. Die sRNAs wurden so konzipiert, dass sie mit unterschiedlichen Bindungsaffinitäten an ihre jeweiligen Zielsequenzen binden, wobei die Bindungsenergie mit der Repressionsstärke korreliert. Die sRNAs binden nicht direkt an die mRNA des Zielgens, sondern an das Startcodon der mRNA eines Transkriptionsfaktors, der das zugehörige Zielgen steuert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Genexpression dynamisch über verschiedenen Bedingungen hinweg durch die Integration synthetischer sRNA in bestehende genetische Konstrukte gesteuert werden kann, ohne Modifikationen, wie z. B. einen Austausch von Promotoren, durchzuführen.

Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells (Tousley et al. 2023) Die Autoren entwickelten einen Ansatz zur Konstruktion eines chimären Antigenrezeptors (CAR), bei dem die herkömmlichen CD3ζ-Domänen für die T-Zell-Aktivierung durch intrazelluläre proximale T-Zell-Signalmoleküle ersetzt sind. Es wurde nachgewiesen, dass einige Signalmoleküle wie ZAP-70 und PLCγ1 nach ihrer Umwandlung in Oberflächenrezeptoren ausreichend sind, um die CAR-T-Zell-Signalübertragung zu initiieren und Tumore in vivo zu beseitigen, ohne dass CD3ζ erforderlich ist. Die Hauptaufgabe von ZAP-70 besteht darin, LAT und SLP-76 zu phosphorylieren, die ein Gerüst für die Signalausbreitung bilden. Die kooperative Rolle von LAT und SLP-76 wurde verwendet, um ein Logic-Gated Intracellular Network (LINK)-CAR zu entwickeln, eine schnelle und reversible Boole'sche Logik-AND-Gated-CAR-T-Zellplattform, die andere Systeme sowohl in der Wirksamkeit als auch in der Vermeidung von On-Target-, Off-Tumor-Toxizität übertrifft. LINK CAR wird die Bandbreite der Moleküle als Ziele von CAR-T-Zellen erweitern und den Einsatz bei soliden Tumoren und verschiedenen Krankheiten wie Autoimmunität und Fibrose ermöglichen.

Engineering a modular double-transmembrane synthetic receptor system for customizing cellular programs (Zhou et al. 2023) Die Autoren haben ein synthetisches Rezeptorsystem entwickelt, das auf zwei intrazellulären Rezeptordomänen basiert, von denen die eine Protease und die andere einen synthetischen Transkriptionsfaktor (TF) trägt, der nach der Spaltung durch die Protease freigesetzt wird. Die Rezeptorkettenenden befinden sich auf der extrazellulären Seite und dimerisieren nach der Bindung eines Liganden, woraufhin die Protease den TF freisetzen kann, der dann die maßgeschneiderten nachgeschalteten Gene transkribiert. Das Rezeptorsystem wurde derart weiterentwickelt, dass es empfindlich auf extrazelluläre Proteinsignale mit minimalen Hintergrundsignalen und positiver Rückkopplung reagiert. Es wurde gezeigt, dass dieses synthetische Rezeptorsystem leicht angepasst werden kann, um auf verschiedene Inputs wie Interleukin-1 (IL-1), programmed death ligand 1 (PD-L1) und HER2 zu reagieren und maßgeschneiderte Outputs freizusetzen, darunter Fluoreszenzsignale und das therapeutische Molekül IL-2.

Conditional Control of Universal CAR T Cells by Cleavable OFF-Switch Adaptors (Kvorjak et al. 2023) Die Autoren haben universelle chimäre Antigenrezeptoren (CARs) weiterentwickelt. Universelle CARs bieten eine bessere Kontrolle über die T-Zell-Funktion, indem sie das Zielantigen nicht direkt binden, wie dies bei herkömmlichen CAR-T-Zellen der Fall ist. Stattdessen bindet der CAR an einen gleichzeitig verabreichten Antikörper-Adapter, der für das Zielantigen spezifisch ist. Die Autoren haben die universellen CARs durch die Entwicklung von Ausschalter-Adaptern weiter verbessert. Diese tragen eine abtrennbare Biotin-Markierung, die durch Zugabe eines kleinen Moleküls (Phosphin-2-(diphenyl-phosphanyl)-benzamid (2DPBM)) oder durch einen Lichtreiz (UV-Licht) entfernt und somit gesteuert werden kann. Darüber hinaus konnten Ausschalter-Adapter in Adapterkombinationstests mehrere Antigene gleichzeitig orthogonal nach Boolescher Logik steuern. Ausschalter-Adapter stellen einen neuen Ansatz für die präzise Ausrichtung universeller CAR-T-Zellen mit dem Potenzial für eine erhöhte Sicherheit dar.

Für diesen Bereich wurden zehn Publikationen ausgewählt.
Mehrere Publikationen befassen sich mit synthetischen Schaltern, die orthogonal zu zellulären Schaltern funktionieren. Beispielsweise wurde in Pflanzen ein Photorezeptor etabliert, der durch blaugrünes Licht aktiviert wird und auch in Pro- und anderen Eukaryoten anwendbar ist (Piccinini et al. 2022). Ein UV-Licht sensitiver Schalter funktioniert, indem eine nicht-kanonische Aminosäure in ein Enzym eingebaut wird, wodurch dieses Enzym nicht mehr durch seinen natürlichen Inhibitor feedback-inhibiert werden kann. Durch Bestrahlung mit UV-Licht wird eine sperrige o-Nitrobenzyl-Gruppe entfernt, sodass dass der Inhibitor wieder an das Enzym binden kann (Bhagat et al. 2022). Für Pflanzen wurden genetische Schaltkreise entwickelt, die eine spezifische Genexpression in verschiedenen Geweben erlauben. Diese Schaltkreise wurden dazu eingesetzt, das laterale Wachstum der Seitenwurzeln von Arabidopsis thaliana zu modifizieren (Brophy et al. 2022). Für die Anwendung in Pflanzen wurden auch orthogonale synthetische Promotoren entwickelt, die unter Kontrolle des endogenen Signalmoleküls Ethylen stehen (Kar et al. 2022). In der Krebstherapie wurden genetische Schaltkreise in Bakterien erforscht, die nach einer Temperaturerhöhung über Ultraschall zu einer gezielten Ausschüttung von Zytokinen führen (Chen et al. 2022). miRNAs werden in künstlichen Logikschaltkreisen, die verschiedene Rechenoperationen in Zellen ausführen können, verwendet. Die miRNAs binden dazu an doppelsträngige DNA-Stränge, sodass diese geöffnet und für weitere Interaktionen frei werden (Chen & Chen 2022). Neuronale Netzwerke wurden ohne die Nutzung von physischen Experimenten in Bakterien dazu programmiert, Rechenoperationen auszuführen oder auf Umweltbedingungen zu reagieren. Schließlich wurden die so getesteten Netzwerke auch in Bakterien implementiert (Becerra et al. 2022). In Säugerzellen wurden Logikgatter gebaut, die auf dem Einbau von zwei verschiedenen nicht-kanonischen Aminosäuren beruhen. Nur bei Vorhandensein einer oder beider nicht-kanonischer Aminosäuren sind diese Schaltkreise aktiv (Mills et al. 2021). Sogenannte Baktoneuronen wurden in Escherichia coli mit jeweils drei inputs und drei outputs konstruiert und bilden zusammen fünf artifizielle Neurosynapsen. Sie werden für zelluläre Rechenoperationen genutzt (Srivastava & Bagh 2022). Mithilfe eines Schaltkreises, bestehend aus Transkriptionsfaktoren, wurde in Säugerzellen Multistabilität erreicht. Dabei kann eine Zelle durch äußere Reize in Kombination mit dem eingebauten Schaltkreis einen bestimmten Zustand einnehmen (Zhu et al. 2022).

LED control of gene expression in a nanobiosystem composed of metallic nanoparticles and a genetically modified E. coli strain (Aratboni et al. 2021) Die Autoren haben eine photothermische Kontrolle der Genexpression mit Hilfe von nichttoxischen metallischen Nanopartikeln, die Licht in Wärme umwandeln, etabliert. Freie Leitungselektronen in Goldnanopartikeln (AuNPs) schwingen bei Beleuchtung, und ein Teil dieser Energie wird als Wärme abgegeben und erhöht die Temperatur des umgebenden Mediums. Die Autoren aktivierten AuNPs mit einer Leuchtdiode in Mikroorganismen, die das fluoreszierende Protein mCherry unter Kontrolle eines U6-RNA-Thermometers exprimieren. RNA-Thermometer kommen natürlicherweise in den 5'-untranslatierten Regionen von mRNAs vor und steuern die Expression nachgeschalteter Gene durch temperaturbedingte Veränderungen ihrer Konformation. Bei niedrigen Temperaturen maskiert das RNA-Thermometer die Ribosomen-Bindungsstelle, bei höheren Temperaturen schmilzt die RNA-Sekundärstruktur lokal und ermöglicht die Ribosomenbindung. Es wurde gezeigt, dass mCherry bei Raumtemperatur nur exprimiert wird, wenn die AuNPs beleuchtet werden. Diese Arbeit bietet eine weitere Möglichkeit zur Kontrolle der Genexpression in biologischen Systemen mithilfe von Beleuchtung.

De novo design of a reversible phosphorylation-dependent switch for membrane targeting (Harrington et al. 2021) Die Autoren entwickelten einen minimalen de novo peptidbasierten molekularen Schalter, der auf einer heterodimeren coiled-coil-Anordnung basiert und bei Phosphorylierung und Dephosphorylierung zwischen einer monomeren und einer dimeren Konformation wechselt. Bei Kopplung an ein membranbindendes Peptid kann der Schalter zwischen einem membrangebundenen und einem gelösten Zustand wechseln. Ein solcher Schalter kann für die Transkriptionsregulierung und den Aufbau orthogonaler, proteinbasierter Schaltkreise verwendet werden.

T cell circuits that sense antigen density with an ultrasensitive threshold (Hernandez-Lopez et al. 2021) Die Autoren konzipierten T-Zell-Schaltkreise, um "off-tumor"-Toxizitäten zu verhindern, die bei der Krebsbehandlung mit chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen häufig auftreten. Die Autoren entwickelten CAR-T-Zellen, die Krebszellen anhand der Antigendichte zuverlässig von normalen Zellen unterscheiden und so eine erhöhte Abtötungsrate von Krebszellen ermöglichen. Durch die Kombination eines synNotch-Rezeptors mit einem CAR wurden ultrasensitive T-Zellen mit einem zweistufigen Erkennungsschaltkreis entwickelt, die den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) erkennen. Der synNotch-Rezeptor erkennt das Antigen mit niedriger Affinität und wirkt so als Filter für Zellen mit hoher Antigen-Dichte. Wenn der synNotch-Rezeptor aktiviert wird, induziert er die Expression eines CAR mit hoher Affinität, der nach seiner Aktivierung die T-Zell-Proliferation und die T-Zell-vermittelte Abtötung von Tumorzellen auslöst. Die neu entwickelten T-Zellen wurden an menschlichen Leukämiezellen (K562), die unterschiedliche Mengen an HER2 exprimieren, auf ihre Fähigkeit getestet, zwischen Zellen mit >10^6,5 und 10^4,5 HER2-Molekülen pro Zelle zu unterscheiden. Diese HER2-Expressionsniveaus entsprechen denen von HER2-exprimierenden Krebszellen bzw. normalem HER2-exprimierendem Gewebe. Die T-Zellen waren in der Lage, die vorgesehenen Diskriminierungsparameter zu erfüllen. In einer gemischten Kultur mit HER2-Zellen hoher Dichte (10⁷) und niedriger Dichte (10^4,8) eliminierten die T-Zellen selektiv die Zellen mit der hohen HER2-Dichte und ließen die Zellen mit der niedrigen Dichte unversehrt. Um zu untersuchen, wie sich diese T-Zellen in einer komplexeren Umgebung verhalten, wurde immungeschwächten Mäusen ein K562-Tumor mit hoher HER2-Dichte auf der einen Seite und ein K562-Tumor mit niedriger HER2-Dichte auf der gegenüberliegenden Seite subkutan in die Flanken injiziert. Nachdem die Tumore etabliert waren, wurden die T-Zellen verabreicht und zeigten eine ausgeprägte Fähigkeit zur Unterscheidung verschiedener HER2-Dichten: Während Tumore mit hoher Dichte aus den Mäusen eliminiert wurden, wuchsen Tumore mit niedriger Dichte weiter. Diese ultrasensitive Unterscheidung zwischen Zellen mit unterschiedlicher Antigen-Dichte stellt ein wichtiges Instrument für die Behandlung solider Tumore mit T-Zellen dar.

Spatiotemporally confined red light-controlled gene delivery at single-cell resolution using adeno-associated viral vectors (Hörner et al. 2021) Die Autoren entwickelten ein virales Vektorsystem basierend auf dem Adeno-assoziierten Virus (AAV) für den Transfer genetischer Informationen in Zellen, welches durch Beleuchtung mit rotem Licht gesteuert wird. AAV-Vektoren transduzieren sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen und werden häufig für die Gentherapie eingesetzt. Die lichtbasierte Steuerung der Systeme kontrolliert die Transduktion auf der Ebene des Zelleintritts. Der AAV-Vektor ist so konstruiert, dass er seinen natürlichen Zelleintrittsrezeptor Heparinsulfat-Proteoglykan nicht erkennen kann, sondern den Phytochrom-Interaktionsfaktor 6 (PIF6) aus Arabidopsis thaliana exprimiert. Um die Interaktion mit der Zielzelle zu ermöglichen, wird ein Adapterprotein benötigt. Das Adapterprotein besteht aus dem Phytochrom B von A. thaliana und einem Ankyrin-Repeat-Protein, das spezifisch für ein Zelloberflächenprotein ist. Bei Beleuchtung mit rotem Licht interagiert der Phytochrom-B-Teil des Adapterproteins mit PIF6 auf dem viralen Vektor, um den Vektor zur Zielzelle zu rekrutieren und die Transduktion einzuleiten. Bei Beleuchtung mit langwelligem rotem Licht wird der virale Vektor von der Zelle getrennt. Durch Umschalten des Adapterproteins können verschiedene Zelltypen angesteuert werden, und das System könnte z. B. für die Gentherapie in vivo eingesetzt werden.

An engineered protein-phosphorylation toggle network with implications for endogenous network discovery (Mishra et al. 2021) Die Autoren entwickelten einen bistabilen Kippschalter, der auf reversiblen Protein-Protein-Phosphorylierungsinteraktionen basiert. Der Schalter enthält zwei Interaktionskreise, die sich gegenseitig unterdrücken, und zwei Eingänge, um zwischen den beiden Zuständen des Systems zu wechseln. Das Proteinnetzwerk wird in Saccharomyces cerevisiae aus elf Proteinen aufgebaut, die entweder aus dem endogenen MAKP-Signalweg stammen oder als exogene chimäre Proteine konstruiert werden, die endogene Proteindomänen mit Domänen aus Arabidopsis thaliana und Mus musculus kombinieren. Die Interaktion zwischen den Proteinen wird durch Phosphorylierung reguliert: ein Protein des einen Kreises interagiert nur dann mit dem Protein des nächsten Kreises, welchen es unterdrückt, wenn es phosphoryliert ist. Das resultierende Kippschalter-Netzwerk weist eine hohe Sensitivität auf, kann schnell auf Eingangssignale reagieren und zeigt über Zellteilungen hinweg eine langfristige Bistabilität. Das Netzwerk ist in der Lage, outputs wie Fluoreszenz oder die Aufhebung der Zellteilung zu kontrollieren. Darüber hinaus entwickelten die Autoren einen Rechenalgorithmus, der 109.401 potenzielle endogene bistabile Signalwege identifizierte. 186 dieser Pfade wurden getestet, und fünf zeigten eine bisher unbekannte Bistabilität. Der auf Proteinen basierende Kippschalter könnte als empfindlicher Umweltsensor oder als mikroelektronisches Gerät für den Einsatz im Darm verwendet werden, wo er medizinische Zustände wie innere Blutungen erkennen könnte.

Light-controllable RNA-protein devices for translational regulation of synthetic mRNAs in mammalian cells (Nakanishi et al. 2021) Die Autoren schufen ein System zur optogenetischen Kontrolle der mRNA-Expression modifizierter RNAs, in die modifizierte Nukleoside eingebaut sind. Die Autoren entwickelten zwei auf Licht reagierende Aktivierungssysteme auf der Grundlage des caliciviralen VPg-basierten Translationsaktivators (CaVT). Bei einem System handelt es sich um einen gespaltenen CaVT, bei dem die RNA-Bindungsdomäne und die Translationsaktivierungsdomäne nur interagieren können, wenn ein Ligand durch Licht freigesetzt wird. Das zweite System verwendet ein mit einer destabilisierenden Domäne fusioniertes CaVT, das schnell abgebaut wird, wenn der Ligand nicht verfügbar ist, und stabilisiert wird, wenn der Ligand durch Licht freigesetzt wird. Das gespaltene CaVT hat den Vorteil, dass es gegenüber kürzeren Expositionszeiten mit den freigesetzten Liganden robuster ist, während das mit einer destabilisierenden Domäne fusionierte CaVT nicht nur aktiviert, sondern auch unterdrückt werden kann. Die kontrollierbare Expression modifizierter RNAs kann für die Gentherapie nützlich sein, da diese RNAs eine höhere Translationseffizienz, geringere Immunogenität und Zytotoxizität und kein Risiko einer Insertionsmutagenese aufweisen.

Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection (Nguyen et al. 2021) Die Autoren haben zellfreie, gefriergetrocknete, gentechnisch veränderte Polynukleotid-Schaltkreise in Materialien wie Textilien oder Silikone eingebettet und so tragbare Sensoren für den Nachweis von kleinen Molekülen, Nukleinsäuren oder Toxinen geschaffen. Sie entwickelten zunächst einen Sensor mit dem lacZ-Operon als output, der zum Nachweis verschiedener inputs verwendet wurde: (1) zum Nachweis von Anhydrotetracyclin über einen Transkriptionsfaktor-gesteuerten Schaltkreis, (2) zum Nachweis von Ebola-Virus-RNA über einen toehold-switch und (3) zum Nachweis des kleinen Moleküls Theophyllin über einen riboswitch. Sensorschaltungen wurden auch in faseroptische Textilien eingebettet, um den Nachweis von viraler (HIV) oder bakterieller (Borrelia burgdorferi) RNA über einen fluoreszierenden oder lumineszierenden output zu ermöglichen. Für den direkten Nachweis von Nukleinsäuren wurde ein Sensor verwendet, der auf einem programmierbaren CRISPR-System basiert. Bei diesem Sensor erkennt eine Cas12a-Protein-gRNA-Kombination eine Ziel-dsDNA und spaltet anschließend eine gequenchte ssDNA-Fluorophorsonde, was zu einem fluoreszierenden output führt. Das CRISPR-System wurde erfolgreich für den Nachweis von Resistenzmarkern von Staphylococcus aureus eingesetzt. Die Autoren nutzten ihr System auch, um einen in eine Gesichtsmaske integrierten Sensor für den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA zu konstruieren, der eine vergleichbare Empfindlichkeit mit dem standardisierten RT-PCR-Test im Labor aufwies.

Chen et al. (2020) entwickelten Logikgatter aus de novo-konstruierten Proteinheterodimeren. Zur Erstellung dieser Logikgatter wurden zunächst wesentliche Eigenschaften der spezifischen Proteinbausteine (Blöcke) definiert: 1) es sollte eine große Anzahl von orthogonalen Paaren geben, um die Gatter-Komplexität nicht zu beschränken, 2) die Blöcke sollten modular und ähnlich aufgebaut sein, um die Gatterkonstruktion zu vereinfachen, 3) einzelne Blöcke sollten in der Lage sein, an verschiedene Partner mit unterschiedlichen und regulierbaren Affinitäten zu binden und 4) die Interaktion der Blöcke sollte kooperativ sein, um zu gewährleisten, dass die Gatter-Aktivierung nicht empfindlich auf stöchiometrische Veränderungen der inputs reagiert. Um diese vier Eigenschaften in ihr Design zu integrieren, nutzten Chen et al. existierende Datensätze orthogonal konstruierter Heterodimere (DHD), welche alle eine identische Struktur aus vier Helizes aufweisen. Die einzelnen Monomere wurden mittels flexibler Linker so modifiziert, dass die Interaktionsdomäne von der Fusionsdomäne verdeckt wird und freie Energie benötigt wird, um diese zu exponieren. Dieser Aufbau stellt sicher, dass ein Logikgatter nur aktiviert werden kann, wenn sich die Bindungsenergien kooperierender DHD-Paare aufsummieren. Die Autoren zeigten, dass die DHD-Logikgatter mittels aufgereinigter Schaltkreiselemente im zellfreien System und in Hefe unter variablen experimentellen Bedingungen funktional sind. Dabei wurde ein fluoreszierendes Protein, dessen Expression unter Kontrolle der Logikgatter stand, als Reporter genutzt. Darüber hinaus wurden Logikgatter auf DHD-Basis mit mehreren inputs getestet, um die Skalierbarkeit des Systems aufzuzeigen. In einem proof-of-concept verfolgten Chen et al. das Ziel, die Expression für das Immun-Checkpoint-Gen für das T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3 (TIM3) zu reprimieren. Hierfür wurde ein „ODER“- Gatter erstellt, bei dem eines der Monomere mit der transcription activator like effector (TALE)-DNA Bindedomäne und das andere mit der Krüppel-associated box (KRAB) Repressordomäne gekoppelt wurde. In der Tat erfolgte keine Expression von TIM3, wenn sich die Monomere in räumlicher Nähe zueinander befanden. Somit ist ein Protein-Logikgatter entstanden, dass aufgrund seiner Flexibilität, Zusammensetzung und Skalierbarkeit eine posttranslationale Kontrolle einer Vielzahl von biologischen Funktionen ermöglichen könnte. - zur Originalliteratur

Frei et al. (2020) generierten miRNA-basierte inkohärente feedforward (iFF)-Schaltkreise, um das Expressionsniveau eines Fremdgens trotz Änderungen des endogenen zellulären Milieus stabil zu halten. Dadurch trägt diese Arbeit zur Entwicklung von robusten synthetischen Schaltkreisen in Säugerzellen bei. Um die notwendigen Daten für das Design der iFF-Schaltkreise zu generieren, untersuchten Frei et al. zunächst, welche Belastung transient exprimierte synthetische Schaltkreise für Säugetierzellen darstellen. Es wurde gezeigt, dass die exogene Genexpression in HEK293T- und H1299-Zellen einen negativen Einfluss auf die Proteinexpression der Wirtszelle hat. Außerdem zeigten die Autoren, dass eine miRNA-vermittelte Herabregulierung die metabolische Belastung eines Schaltkreises vermindern kann. Basierend auf diesen Daten wurde ein Modell für synthetische Schaltkreise etabliert, in dem die Expression eines Fremdgens von endogenen zellulären Veränderungen entkoppelt ist. Das Modell war in der Lage, sich an bestehende Schaltkreistopologien wie open-loop und iFF-Schaltkreise anzupassen, um Pools von gemeinsam genutzten und begrenzten Ressourcen einzubeziehen. Als proof-of-concept wurde ein iFF-Schaltkreis mit einer miRNA-vermittelten Herabregulierung in silico und in vitro getestet, bei dem miRNA-target sites verwendet wurden, die komplementär zu einer endogenen oder synthetischen miRNA sind. Wie erwartet reagierte der iFF-Schalkreis weniger empfindlich auf Veränderungen der verfügbaren Ressourcen. - zur Originalliteratur

Krawczyk et al. (2020) haben einen genetischen Schaltkreis entwickelt, in dem die elektrische Stimulation humaner Zellen die Expression eines Transgens bzw. Sekretion von Protein-Therapeutika aus intrazellulären Vesikeln auslöst. Dabei wird die elektronische Information über eine Depolarisierung der Zellmembran in Proteinproduktion und –sekretion umgewandelt. Die Autoren fügten den spannungsabhängigen L-Typ-Kalziumkanal in die Membran von Säugerzellen ein. Die Kalziumkanäle öffnen sich, wenn die Membran durch einen elektrischen Impuls depolarisiert wird und lassen Kalzium einströmen, wodurch die Expression eines Zielgens über den nuclear factor of activated T cells (NFAT) induziert wird. Als proof-of-concept wurden humane β-Zellen, die nach Kalziumeinfluss Insulin sekretieren, durch Expression des Ionenkanals elektrosensitiv gemacht. Die Zellen wurden dann in ein bioelektronisches Implantat integriert, welches kabellos stimuliert werden kann. Nach Implantierung in Mäuse mit Diabetes Typ I waren die elektrosensitiven Zellen in der Lage, auf einen elektrischen Impuls hin Insulin zu sezernieren und den Blutglukosespiegel auf einen normalen Wert abzusenken. - zur Originalliteratur

Lajoie et al. (2020) entwarfen co-lokalisationsabhängige Proteinschalter (Co-LOCKR), die Boolesche UND-, ODER- und NICHT-Verknüpfungen durchführen, um ein spezifisches Zell-targeting zu ermöglichen. So kann beispielsweise eine spezifische Kombination von Antigenen auf der Oberfläche einer Tumorzelle erkannt werden und eine anti-Tumor-Antwort eingeleitet werden. Die Arbeit basiert auf dem LOCKR-Schalter (Langan et al. 2019), bei dem ein Proteinkäfig durch ein verriegelndes Protein inaktiv gehalten wird, bis ein Schlüsselprotein bindet und die Interaktion mit dem Effektorprotein ermöglicht. Für Co-LOCKR wurde eine neue Version mit kürzeren Helices, einer verbesserten hydrophoben Packung und einem zusätzlichen Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk generiert. Um den Co-LOCKR-Käfig und die Schlüsselproteine an einer Zelle zu rekrutieren, die bestimmte Zielantigene exprimiert, wurden target-Domänen hinzugefügt. Die Autoren zeigten, dass der Proteinkäfig und der Schlüssel durch die target-Domänen in einem UND-Schaltkreis zu Her2- und EGFR-exprimierenden Zellen rekrutiert werden. Beim Hinzufügen eines zweiten Schlüssels wurde ein ODER-Schaltkreis eingeführt. Eine NICHT-Logik wurde durch Hinzufügen eines Köder-Proteins etabliert, das als molekularer Schwamm für den Schlüssel fungiert und mit einer target-Domäne gegen einen zu vermeidenden Oberflächenmarker fusioniert ist. In einem proof-of-principle-Experiment generierten die Autoren chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen, die ein exogen exprimiertes Protein auf Zellen erkennen. Die CAR-T-Zellen waren spezifisch gegen Tumorzellen gerichtet, die Her2 und EGFR exprimieren, wenn der Co-LOCKR, der Schlüssel, und die target-Domäne hinzugefügt wurden. In Experimenten, in denen CAR-T-Zellen mit UND/ODER- oder UND/NICHT-Co-LOCKRs und Tumorzellen, die das designierte Antigen aufweisen, co-kultiviert wurden, führte der Co-LOCKR den erwarteten Schaltkreis aus, was zur T-Zell-Proliferation bei einer spezifischen Antigenkombination führte. In einer Co-Kultur verschiedener Tumorzellen war Co-LOCKR in der Lage, eine Zelllinie anhand ihrer Antigenkombination zu identifizieren. - zur Originalliteratur

Pinto et al. (2020) charakterisierten eine Bibliothek mit 34 getrennten Inteinen (internal proteins). Inteine sind auto-katalytische Proteinsegmente, die sich selbst aus einem größeren Vorläuferpeptid ausschneiden. In diesem als Protein-Spleißen bekannten Prozess werden anschließend die angrenzenden Aminosäurereste durch neue Peptidverbindungen verknüpft und das Intein entfernt. Getrennte Inteine verbinden zwei Hälften eines Proteins, die von verschiedenen Genen exprimiert werden. Die Autoren nutzten ein getrenntes mCherry-Protein, um die Fähigkeit der Inteine zum cis-Spleißen (beide Proteinhälften auf dem gleichen Plasmid) und zum trans-Spleißen (Proteinhälften und getrennte Inteine werden auf unterschiedlichen Plasmiden exprimiert) unter gleichen Bedingungen untersuchen zu können. Sie identifizierten 15 zueinander orthogonale getrennte Intein-Paare, die sowohl cis- als auch trans-spleißen konnten. Zehn dieser Paare konnten in einem zellfreien System auch simultan genutzt werden. Die getrennten Inteine wurden anschließend in einem biologischen Schaltkreis genutzt, indem sie an getrennte transkriptionelle Regulatoren fusioniert und in Schaltkreisen mit zwei inputs und zwei outputs sowie solchen mit jeweils drei inputs und outputs genutzt wurden. In einer weiteren Anwendung wurden die getrennten Inteine genutzt, um große repetitive Proteine aus mehreren Peptiden zusammenzusetzen. So können die getrennten Inteine auch zur Herstellung von Biomaterialien genutzt werden. - zur Originalliteratur

Wiechert et al. (2020) haben induzierbare Promotoren für eine präzise induzierbare Expression entwickelt und getestet, die auf dem bakteriellen Mechanismus des xenogenen counter-silencing beruhen. Xenogene silencer sind Nukleoid-assoziierte bakterielle Proteine, die bevorzugt an horizontal erworbene AT-reiche DNA binden. Die Autoren verwendeten den xenogenen silencer CspS, ein von Prophagen kodiertes Protein aus Corynebacterium glutamicum. CspS agiert als silencer, indem es an einen Zielpromotor bindet, oligomerisiert und einen Nukleoproteinkomplex bildet, der die Transkription inhibiert. Um diese Hemmung zu regulieren, wurde ein synthetischer counter-silencer in die Promotorsequenzen eingebaut, und zwar die Operatorssequenz des Transkriptionsfaktor GntR. GntR bindet an den synthetischen counter-silencer-Promotor und interferiert mit dem Nukleoproteinkomplex, so dass die Transkription beginnen kann. Es wurden 44 synthetische counter-silencer-Promotoren identifiziert. Darüber hinaus wurde das System verwendet, um einen Kippschalter in C. glutamicum zu generieren, der zwischen Zellwachstum und L-Valin-Produktion umschaltet. - zur Originalliteratur

Williams et al. (2020) haben an der kombinatorischen Erkennung von Antigen-Mustern auf Tumorzellen gearbeitet, um Krebszellen spezifisch erkennen zu können. Die Autoren verwendeten mehrere synthetische Notch-Rezeptoren (synNotch), um eine Reihe von Rezeptoren und outputs flexibel zu Schaltkreisen zu verknüpfen. In einem drei-input-UND-Logikgatter erkennt der erste synNotch-Rezeptor das Antigen 1, wird aktiviert und induziert die Expression eines zweiten synNotch-Rezeptors. Wird dieser synNotch-Rezeptor durch das erkennende Antigen 2 aktiviert, wird ein chimärer Antigenrezeptor (CAR) exprimiert, der das dritte Antigen bindet und zur Abtötung der Zielzelle führt. Als Alternative zum drei-input-UND-Logikgatter testeten die Autoren auch ein drei-input-UND-NICHT-Logikgatter, bei dem ein synNotch zur Aktivierung eines CAR führt und ein dritter synNotch-Rezeptor, falls aktiviert, die Expression eines pro-apoptotischen Proteins induziert. In diesem Schaltkreis führt die Anwesenheit nur der ersten beiden Antigene zur Abtötung einer Tumorzelle, während die Anwesenheit von Antigen 3 die T-Zelle selbst zerstört. - zur Originalliteratur

Aoki et al. (2019) - Basierend auf dem Ingenieursprinzip des integralen Reglers wurde erstmals ein geschlossener biologischer Regelkreis in lebende E. coli-Zellen integriert. Dazu werden die Bacillus subtilis-σ- und anti-σ-Faktoren (SigW und RsiW) genutzt. SigW aktiviert die Expression von araC sowie des gene of interest (GOI), das durch den Regelkreis stabil gehalten werden sollte. Der anti-σ-Faktor RsiW bindet und inaktiviert SigW, sodass weniger araC und GOI exprimiert werden. Da RsiW gleichzeitig unter Kontrolle eines araC-abhängigen Promotors steht, wird bei geringerer araC-Konzentration auch weniger RsiW gebildet. Hieraus ergab sich ein Regelkreis, der in Experimenten auch Störungen, wie Temperaturschwankungen, Stand hielt. Als proof-of-principle nutzen die Autoren das Methionin-Synthetasegen als GOI, ein Enzym, welches in Methionin-freiem Medium essentiell für das Wachstum der Zellen ist. Der Regelkreis führte zu einer stabilen Wachstumsrate der Zellen. - zur Originalliteratur

Chung et al. (2019) entwickelten einen genetischen Schaltkreis, der ein bestimmtes, auf der Oberfläche von Krebszellen überexprimiertes Protein (ErbB) erkennt und daraufhin die Apoptose der Krebszelle induziert. Das System besteht aus zwei Proteinen: einer Protease, die an eine Phosphotyrosin-Bindedomäne (PBD) fusioniert ist, und einem Protein, welches an die Zellinnenseite bindet und eine beliebige Fracht trägt. Die Protease bindet mithilfe der PBD nur an konstitutiv phosphoryliertes ErbB, wie es vor allem in Krebszellen vorliegt und kommt dadurch in räumliche Nähe zur Zellmembran. Die Protease kann dann die Fracht abspalten und beispielsweise die Apoptose der Zelle induzieren. Das System wurde bereits über einen Adeno-assoziierten Vektor in pankreatische Krebszellen und gesunde Hepatozyten eingebracht und eine selektive Apoptose der Krebszellen gezeigt. - zur Originalliteratur

Huang et al. (2019) - In der Therapie von soliden Tumoren werden vermehrt onkolytische Viren genutzt. Um eine höhere Tumorspezifität und eine verbesserte onkolytische Wirkung zu erreichen, erstellten Huang et al. programmierbare onkolytische Adenoviren. Diese enthalten einen Schaltkreis, bestehend aus einem tumorspezifischen Promotor, einer tumorspezifischen microRNA und einer hauptsächlich in gesunden Zellen exprimierten microRNA. Ist der tumorspezifische Promotor aktiviert, die tumorspezifische microRNA erhöht und die für gesunde Zellen spezifische microRNA wenig vorhanden, exprimiert das Adenovirus den Faktor E1 und einen Immuneffektor. Dadurch konnte sowohl eine verbesserte onkolytische Wirkung als auch eine hohe Gewebespezifität für hepatozelluläre Karzinome erreicht werden. - zur Originalliteratur

Langan et al. (2019), Ng et al. (2019) - Zur Implementierung einer synthetischen feedback-Kontrolle für endogene Signalwege und synthetische genetische Schaltkreise wurde im ersten Schritt ein de novo-Proteinsystem (LOCKR-Switch) entwickelt, welches zur Konformationsänderung fähig ist (Langan et al.). Das System besteht aus einem Bündel von sechs Helices, wovon fünf den Protein-Käfig bilden und die sechste Helix eine Protein-Falle mit integrierter Peptidsequenz zur Bindung des Zielmoleküls darstellt. In der Ursprungskonformation ist die sechste Helix an den Käfig gebunden und die Falle unzugänglich für das Zielmolekül. Die Zugabe eines zum Käfig homologen kompetitiven Schlüssels geht mit einer Änderung der Konformation der Helices einher, in welcher die Bindestelle für das Zielmolekül so exponiert wird, dass die Protein-Falle funktionell wird. Auf diesem System aufbauend implementierten Ng et al. eine synthetische feedback-Kontrolle für endogene Signalwege und synthetische genetische Schaltkreise. In der zweiteiligen Arbeit wurde zunächst ein degronLOCKR-Switch (Langan et al.) verwendet, um die native MAPK-Signalkaskade in Hefe so zu modulieren, dass ein erhöhter oder verringerter output der Signalkaskade induziert werden konnte. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Anwendung des degronSwitches in synthetischen genetischen Schaltkreisen. Hierfür wurde in Hefe eine einfache, hormonell beeinflussbare, synthetische Transkriptionskaskade mit und ohne feedback-Kontrolle getestet, die aus zwei induzierbaren degronSwitch-fusionierten Transkriptionsfaktoren (GEM, Z3PM9) besteht. Im direkten Vergleich mit dem Schaltkreis ohne feedback-Kontrolle war der Schaltkreis mit feedback-Kontrolle anpassungsfähiger gegenüber äußeren Einflüssen (Hormonkonzentrationsveränderungen) und stellt somit die Grundlage zur Implementierung komplexer synthetischer Funktionen in Zellen dar. - zur Originalliteratur: Langan et al. (2019), Ng et al. (2019).

Liao et al. (2019) - Komplexe Schaltkreise gehen in Zellen oft durch evolutionäre Prozesse verloren, da sie mit einem Fitnessverlust einhergehen. Um diese Verluste zu vermeiden, nutzen die Autoren eine Ko-Kultur mit drei nacheinander eingesetzten E. coli-Stämmen, die jeweils ein Toxin-Antitoxin-System (TA-System) enthalten. Neben dem jeweils individuellen TA-System kodiert ein solcher Stamm auch für ein Antitoxin eines der anderen Stämme. Dadurch wird sichergestellt, dass Bakterien ohne das passende Antitoxin in der Ko-Kultur schnell abgetötet werden und von solchen mit dem Antitoxin ersetzt werden. Somit ist der neu hinzugegebene Bakterienstamm mit dem Antitoxin resistent gegenüber den zuvor gewachsenen Bakterien und kann nun die Kultur dominieren. In einem Rotationsprinzip könnte der zweite Stamm dann durch einen dritten ersetzt werden und dieser wiederum durch den ersten, bevor Mutationen zu unerwünschten Effekten führen. Durch dieses Prinzip bleibt der zweite Schaltkreis, der in allen drei Stämmen auf dem gleichen Plasmid wie das TA-System enthalten ist, stabil in der Kultur erhalten. Als proof-of-principle wurde ein Schaltkreis zur populationsabhängigen Lyse verwendet, der bei ausreichend hoher Konzentration eines quorum sensing-Moleküls die Lyse der Zellen auslöst. Normalerweise herrscht bei diesem Schaltkreis ein hoher Selektionsdruck, sodass sich die Zellen nach zwei Tagen adaptieren und keine Lyse mehr stattfindet. Durch das Rotationsprinzip im TA-System konnte die Bildung von Mutanten verhindert und die Langlebigkeit des Schaltkreises deutlich verlängert werden. - zur Originalliteratur

Pandi et al. (2019). Zur Erstellung von komplexen Schaltkreisen für die Synthetische Biologie, entwickelten Pandi et al. Signalwandler-Aktuator-Modelle in silico und testeten diese in Escherichia coli. Dabei bestehen die Modelle aus einem Signalwandler, welcher für das Gen eines Enzyms kodiert, welches ein Eingangssubstrat (z. B. Hippursäure, Kokain) in einen Ausgangsmetaboliten (z. B. Benzoat) umwandelt. Der Ausgangsmetabolit fungiert wiederum als Aktuator und reguliert die Expression eines Ausgangssignales (GFP). Durch die Kombination von zwei oder mehr Enzymgenen zur Konvertierung von Substraten wie z. B. Hippursäure oder Benzaldehyd in einem Operon entsteht ein analoger metabolischer Konzentrationsaddierer. Durch diesen Konzentrationsaddierer verstärkt sich die Fluoreszenz, wenn die Konzentration bereits eines der Metaboliten steigt. Das Signalwandler-Aktuator-System wurde zusätzlich in einem zellfreien System untersucht, in welchem der Signalwandler durch Zugabe verschiedener Konzentrationen der Enzym-kodierenden DNA gewichtet wurden. Dabei korreliert die Menge an zugegebener Enzym-DNA direkt mit der GFP-Fluoreszenz: je mehr Enzym-DNA zugegeben wird, desto stärker ist das GFP-Fluoreszenzsignal. Dieses gewichtete Signalwandler-Aktuator-System wurde als ein einlagiges metabolisches Perzeptron definiert. Das Perzeptron ist ein biologischer Rechenalgorithmus, welcher die Fähigkeiten der Neuronen zur Informationsverarbeitung, zum Lernen und zur Entscheidungsfindung nachahmt. Ähnlich wie Neurone sollten metabolische Perzeptrone in der Lage sein, mehrere Eingangssignale in Form von Substraten zu empfangen und diese, in Abhängigkeit von der gewichteten Summe der Eingangssignale, in einen Signalausgang, und zwar in Form einer spezifischen Transkription eines Zielgens, umzuwandeln. Das Perzeptron ist per se ein binärer Klassifizierer. Dies bedeutet, dass die Entscheidung AN getroffen wird und es zur Expression des Fluorophors kommt, wenn die berechnete gewichtete Summe einen vordefinierten Schwellenwert erreicht. Andernfalls bleibt das System auf AUS. Die Autoren erstellten ein metabolisches binäres Logikgatter-Perzeptron mit vier Eingängen, welches durch die unterschiedlichen Gewichtungen der einzelnen Detektoren in der Lage ist, unterschiedliche Mengen von Eingangssubstraten zu klassifizieren. In vitro-Experimente bestätigten, das mit dem in silico-Modell genaue Vorhersagen über die entsprechenden Gewichtungen getroffen werden können, um das vollständige ODER Logikgatterverhalten zu erreichen. In dieser Arbeit wurden eine analoge Signalverarbeitung und ein digitales Ausgangssignal so miteinander kombiniert, dass zukünftig komplexe Schaltreise entwickelt werden können, die eine schnelle und skalierbare Multiplex-Signalerfassung ermöglichen. - zur Originalliteratur

Saltepe et al. (2019) - Nanopartikel (NP) spielen zunehmend eine größere Rolle in klinischen Anwendungen und können unter Anderem zum Transfer von Chemotherapeutika in Tumorgewebe verwendet werden. In der Entwicklung neuer NP sind vor allem die Zytotoxizität und die Biokompatibilität von essentieller Bedeutung. Um für ein erstes Testverfahren einen zuverlässigen und schnellen Toxizitätssensor für das NP compound screening zu generieren, etablierten Saltepe et al. in E. coli einen genetischen Schaltkreis auf Basis des heat shock response-Mechanismus (HSR) von Mycobacterium tuberculosis. Dieser Mechanismus reagiert auf den durch toxische NP induzierten zellulären Stress mit der Aktivierung des HSR-Promotors und der Expression eines nachgeschalteten fluoreszierenden Reportergens. Im Ergebnis ist ein Test entstanden, welcher ein schnelles und einfaches optisches Auslesen ermöglicht. - zur Originalliteratur

Purcell et al. (2018) stellen zwei Ansätze vor, mit denen das Design synthetischer Schaltkreise verschlüsselt werden kann, um den Schutz intellektuellen Eigentums sicherzustellen. Es soll verhindert werden, dass der Aufbau der genetischen Schaltkreise durch die Sequenzierung des Gesamtgenoms der Organismen entschlüsselt wird. Ein Ansatz nutzt ortsspezifische, unidirektionale Rekombinasen und deren Erkennungssequenzen, um die Anordnung des Schaltkreises zu verändern, wenn dieser nicht in Benutzung ist. Der zweite Ansatz basiert darauf, dass zusätzliche, für den Schaltkreis nicht wichtige Gene, als eine Art Camouflage verwendet werden. Nach Zugabe eines „molekularen Schlüssels“ werden die Effekte dieser Gene entfernt und der korrekte Schaltkreis funktioniert. Dieser Schlüssel kann zum Beispiel ein Plasmid sein, welches die Komponenten für eine CRISPR-Interferenz enthält und so zu einer Repression (der Expression) der Camouflage Gene führt.- zur Originalliteratur

Segall-Shapiro et al. (2018) haben einen inkohärenten feedforward loop entwickelt, der eine konstante Genexpression durch einen bestimmten Promotor bewirkt, unabhängig von der Kopienzahl des Plasmides oder der Lokalisation im Genom. Dieses System soll genutzt werden, wenn ein Gleichgewicht in der Genexpression verschiedener Enzyme, z. B. für einen maßgeschneiderten Stoffwechselweg, wichtig ist. Da Zellen im Wachstum dynamischen Einflüssen unterliegen, müssen ansonsten nach dem Einbringen eines Stoffwechselweges beispielsweise von einem Plasmid in ein Genom oft aufwändige Anpassungen vorgenommen werden. Die Autoren haben einen Repressor genutzt, der an den Promotor des Zielgens bindet. Das Gen für diesen konstitutiv exprimierten Repressor wurde vor das Zielgen kloniert, sodass beide Gene denselben Einflüssen und Störungen unterworfen sind und die Expression unabhängig von der Kopienzahl reguliert wird. - zur Originalliteratur

Toda et al. (2018) beschreiben ein synthetisches Netzwerk der Zell-Zell-Kommunikation, welches maßgeschneiderte komplexe und auch asymmetrische multizelluläre Strukturen generiert. Damit sollen synthetische, selbst-organisierende Gewebe oder Biomaterialien hergestellt werden. Der Schaltkreis basiert auf der synNotch juxtacrine signaling-Plattform und wurde so konzipiert, dass spezifische Zell-Zell-Kontakte zu einer Änderung in der Cadherin-Zell-Adhäsion und dadurch zu einer Differenzierung sowie zur Produktion von neuen Zell-Zell-Signalen führen. - zur Originalliteratur

Es wurden keine Publikationen aus dem Jahr 2025 ausgewählt.

Advancing the scale of synthetic biology via cross-species transfer of cellular functions enabled by iModulon engraftment (Choe et al. 2024)

Die Autoren haben Transkriptomdatenbanken analysiert und dadurch sogenannte iModulons identifiziert. Dabei handelt es sich um Gruppen von ko-exprimierten, aber potenziell unabhängig voneinander regulierten Genen, die für eine spezifische zelluläre Stoffwechselleistung verantwortlich sind. Dabei werden auch noch nicht annotierte Gene erfasst. Die Identifizierung von iModulons ermöglicht die genaue Identifizierung von Genen, die für den Transfer zellulärer Funktionen zwischen verschiedenen Spezies benötigt werden. iModulons können durch adaptive Evolution im Labor weiter verbessert werden, sodass der neue Wirtsorganismus den übertragenen Stoffwechselweg unter Selektionsdruck optimal nutzt und anpassungsbedürftige Wirtsfaktoren identifiziert werden können. Im vorliegenden Ansatz wurden drei Stoffwechselwege und eine Antibiotikaresistenzeigenschaft von Pseudomonas auf E. coli übertragen. Dieser Arten-übergreifende Transfer von Stoffwechselwegen ist schnell und präzise und könnte ein wertvolles Werkzeug bei der Generierung bestimmter Produktionsstämme sein.

De novo design of proteins housing excitonically coupled chlorophyll special pairs (Ennist et al. 2024)

Ennist et al. inkorporierten das zentrale Reaktionszentrum des natürlichen Photosynthese-Komplexes LH1-RC, welches aus zwei Chlorophyll-Molekülen (special pair) besteht, funktionell in Designer-Proteine. Das special pair wird mit Lichtenergie angeregt, die erzeugte Ladungstrennung initiiert die Elektronen-Transfer-Kaskade, die zur Produktion von energiereichen Verbindungen in der Zelle führt. Die Autoren synthetisierten ein c2-symmetrisches Protein, das zwei Chlorophyllmoleküle nah beieinander und in der gleichen Orientierung bindet, wie es bei dem nativen special pair der Fall ist. Spektroskopische Analysen zeigten, dass die Chlorophylle exzitonisch gekoppelt sind, und die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung wies einen Energietransfer nach. Durch seine Symmetrie konnte das synthetische special pair auch erfolgreich in größere Subkomplexe eingebaut werden. Ein erzeugter oktaedrischer Nanokäfig mit dem synthetischen Protein, 24 synthetischen Chlorophyll-Molekülen, und einem special pair an jedem Ende ist ein erster Schritt in Richtung eines de novo-Designs von photosynthetischen Kompartimenten, die Thylakoiden oder Chromatophor-Vesikeln entsprechen. Die Studie setzt den Grundstein für die Untersuchung der Photophysik von special pairs, unabhängig von der Komplexität natürlicher photosynthetischer Proteine und stellt den ersten Schritt zur Entwicklung synthetischer Photosysteme für neue Energieumwandlungstechnologien dar.

New-to-nature CO₂-dependent acetyl-CoA assimilation enabled by an engineered B12-dependent acyl-CoA mutase (Schulz-Mirbach et al. 2024)

Acetyl-CoA ist ein Schlüssel-Intermediat bei der C1-Kohlenstoff-Assimilation, bei der C1 nach seiner Bildung in höhere Verbindungen und Biomasse eingebaut wird. Bei aeroben Stoffwechselwegen wird zuvor bereits fixiertes CO₂ während der weiteren Verarbeitung freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit haben die Autoren das synthetische Lactyl-CoA Mutase (Lcm)-Modul entwickelt, um diesen Verlust zu vermeiden. Das Lcm-Modul stellt eine direkte Verbindung zwischen Acetyl-CoA und Pyruvat her und setzt kein CO₂ frei. Dafür wurde eine neue, synthetische Coenzym B12-abhängige Mutase genutzt, die 3-Hydroxypropionyl-CoA in Lactyl-CoA umwandelt. Als Basis wurde die 2-Hydroxyisobutyryl-CoA Mutase von Bacillus massiliosenegalensis verwendet. Die katalytische Effizienz von Lcm in E. coli wurde via adaptiver Evolution und Hypermutation mit dem eMutaT7-System verbessert. Das Lcm-Modul muss hinsichtlich Effizienz, Stabilität und Sauerstofftoleranz noch verbessert werden, wird jedoch als Alternative für verschiedene mikrobielle Produktionsanwendungen in der Zukunft gesehen.

ATP production from electricity with a new-to-nature electrobiological module (Luo et al. 2023)
Die Autoren haben ein neues elektrobiologisches Modul, den Säure/Aldehyd-ATP-Zyklus (AAA-Zyklus) konstruiert. Das Modul ermöglicht einer Zelle, elektrische Energie direkt in ATP umzuwandeln. Der AAA-Zyklus besteht aus vier Enzymen und erfordert keine membranbasierte Ladungstrennung. Zudem kann er an andere in vitro Prozesse wie Transkriptions-/Translationssysteme gekoppelt werden. Die Leitung von Elektronen in das Modul wird durch Hexamethylviologen erreicht, wodurch die direkte Speicherung von Elektrizität als Energie in biologischen Systemen ermöglicht wird.

Complete integration of carbene-transfer chemistry into biosynthesis (Huang et al. 2023)
Die Autoren haben die unnatürliche Carben-Transfer-Reaktion erstmals in einen Biosyntheseweg eines Bakteriums eingefügt. Die Carben-Transfer-Reaktion ist ein Paradebeispiel für eine Reaktion, die synthetischen Chemikern zur Verfügung steht, in der Biologie jedoch fehlte. Dies führte zu einer begrenzten Vielfalt an Produkten in der Biosynthese im Vergleich zur synthetischen Chemie. Das biosynthetische Gencluster für das natürliche α-Diazoester-Azaserin aus Streptomyces fragilis wurde in Streptomyces albus eingefügt. Die Autoren zeigen, dass Azaserin als Carben-Donor für Cyclopropanat, ein intrazellulär produziertes Styrol, dient, um unnatürliche Aminosäuren mit einer Cyclopropylgruppe zu erzeugen. Die Reaktion wird in S. albus durch ein mutiertes Cytochrom-P450-Enzym mit seinem nativen Kofaktor katalysiert. Die Studie schafft eine skalierbare mikrobielle Plattform für die Durchführung intrazellulärer abiologischer Carben-Transfer-Reaktionen zur Funktionalisierung einer Reihe natürlicher und neuartiger Produkte und erweitert das Spektrum organischer Produkte, die durch zellulären Stoffwechsel hergestellt werden können.

Manipulation of sterol homeostasis for the production of 24-epi-ergosterol in industrial yeast (Jiang et al. 2023)
Die Autoren haben eine Hefezellfabrik für die skalierbare Produktion von 24-Epi-Ergosterol aufgebaut. 24-Epi-Ergosterol ist ein unnatürliches Sterin, das als Vorstufe für die Semisynthese von Brassinolid verwendet werden kann, einem Pflanzenhormon, das aufgrund seines extrem geringen natürlichen Vorkommens und des Mangels an synthetischen Vorstufen das Potenzial für eine Vielzahl von landwirtschaftlichen Anwendungen hat. Die Autoren konstruierten den künstlichen Stoffwechselweg, indem sie zunächst eine Δ24(28)-Sterol-Reduktase (DWF1) aus Pflanzen in die Hefe Saccharomyces cerevisiae einführten. Eine enzymgesteuerte Evolution folgte, um die katalytische Aktivität von DWF1 zu erhöhen und die de novo-Biosynthese von 24-Epi-Ergosterol zu ermöglichen. Die Bildung von 24-Epi-Ergosterol wurde durch die Entwicklung einer Sterolhomöostase mittels Überexpression von drei endogenen Genen (YEH1, YEH2 und ARE2) weiter verstärkt. Die Strategie zur Entwicklung der Sterolhomöostase kann für die Massenproduktion anderer wirtschaftlich wichtiger Phytosterole eingesetzt werden.

Construction and modular implementation of the THETA cycle for synthetic CO2 fixation (Luo et al. 2023)
Die Autoren haben einen für die Natur neuen CO₂-Fixierungsweg konstruiert, den THETA-Zyklus (Tricarbonsäure-Zweig/4-Hydroxybutyryl-CoA/Ethylmalonyl-CoA/Acetyl-CoA). Der THETA-Zyklus umfasst 17 Enzyme aus 9 Organismen und konzentriert sich auf zwei der effizientesten in der Natur beschriebenen CO₂-fixierenden Enzyme, Crotonyl-CoA-Carboxylase/Reduktase und Phosphoenolpyruvat-Carboxylase. Rationale und auf maschinellem Lernen basierende Optimierungsansätze haben die Ausbeute des Zyklus um zwei Größenordnungen verbessert und die Bildung verschiedener biochemischer Bausteine direkt aus CO₂ nachgewiesen. Der THETA-Zyklus wurde in drei Module unterteilt, die in vivo in Escherichia coli implementiert wurden. Dies stellt den ersten Schritt zur Realisierung hochgradig orthogonaler und komplexer CO₂-Fixierungswege in lebenden Zellen dar.

Construction of an artificial phosphoketolase pathway that efficiently catabolizes multiple carbon sources to acetyl-CoA (Yang et al. 2023) Die Autoren haben einen künstlichen Phosphoketolase-Stoffwechselweg (APK) entworfen und konstruiert, der nur aus drei Arten biochemischer Reaktionen besteht und das Potenzial hat, aus jedem Monosaccharid eine 100-prozentige Kohlenstoffausbeute zu Acetyl-CoA zu erzielen. Das zentrale Enzym in diesem Stoffwechselweg ist die Phosphoketolase, während Phosphatase und Isomerase als Hilfsenzyme fungieren. Für die Umwandlung von Fructose-6-phosphat umfasst der APK-Stoffwechselweg Phosphoketolase (PK) aus Actinobacteria bifidobacterium (BbPK), Haloacid-Dehalogenase (HAD)-ähnliche Hydrolase (EcHAD) aus Escherichia coli und L-Rhamnose-Isomerase (Ps-LRh I) aus Pseudomonas stutzeri, während an der Umwandlung von Xylulose-5-phosphat BbPK, Triosephosphat-Isomerase (EcTIM) aus E. coli, Zuckerphosphatase aus Candida parapsilosis (CpHAD) und Formolase (FLS), ein synthetisches Enzym, beteiligt waren. Der APK-Stoffwechselweg wurde in vitro getestet und es wurde nachgewiesen, dass typische C1-C6-Kohlenhydrate effizient zu Acetyl-CoA mit einer Ausbeute von 83 % bis 95 % metabolisiert wurden. Darüber hinaus haben die Autoren E. coli-Stämme entwickelt, die in der Lage sind, mit Hilfe des APK-Stoffwechselweges zu wachsen, wenn Glycerin als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Der neuartige APK-Stoffwechselweg hat das Potenzial, in Zukunft mehrere Kohlenstoffquellen mit höherer Effizienz in der Bioproduktion zu nutzen.

Engineering α-carboxysomes into plant chloroplasts to support autotrophic photosynthesis (Chen et al. 2023)
Die Autoren erzeugten morphologisch korrekte Carboxysomen in Tabakchloroplasten durch Einfügen von genetischen Komponenten des α-Carboxysoms aus dem Proteobakterium Halothiobacillus neapolitanus. Das voll funktionsfähige α-Carboxysom besteht aus Komponenten, die von neun Carboxysom-Genen kodiert werden, und ersetzt das endogene rbcL-Gen von Tabak, das die Ribulose-1,5-biphosphat-Carboxylase/Oxygenase (Rubisco) kodiert, ein wichtiges Enzym, das an der Kohlenstofffixierung beteiligt ist. Die plastidären α-Carboxysomen unterstützen das Wachstum von Tabakpflanzen und die autotrophe Photosynthese bei erhöhten CO₂-Konzentrationen. Diese Arbeit ebnet den Weg zur Verbesserung der Photosynthese und Produktivität von Nutzpflanzen.

Engineering a new-to-nature cascade for phosphate-dependent formate to formaldehyde conversion in vitro and in vivo (Nattermann et al. 2023) Die Autoren haben einen neuen Weg entwickelt, um unter Verwendung von zwei Enzymen und anorganischem Phosphat (Pi). Formiat zu Formaldehyd zu reduzieren. Zunächst wird Formiat mit Acetatkinase aus Escherichia coli zu Formylphosphat phosphoryliert und aktiviert. Mit einer Variante der N-Acetyl-γ-Glutamylphosphat (NAGP)-Reduktase (ArgC) aus dem Bakterium Denitrovibrio acetiphilus erfolgt eine Reduktion zu Formaldehyd. Mit einem semirationalen Ansatz der Enzymtechnik haben die Autoren eine neue Formylphosphat-Reduktase-Variante von ArgC entwickelt. Das Enzym ist eine Dreifach-Substitutionsvariante des Enzyms, die einen vollständigen Verlust der nativen Enzymaktivität (d. h. NAGP-Reduktion), eine 300-fache Verschiebung der Spezifität in Richtung Formylphosphat und eine verringerte Neigung zu Nebenreaktionen mit Acetylphosphat aufweist. Die Funktionalität des Stoffwechselwegs wurde sowohl in vitro als auch in vivo in E. coli nachgewiesen. Darüber hinaus wurde der Pi-basierte Weg mit einem kürzlich entwickelten Formaldehyd-Assimilationsweg, dem FORCE-Weg (Chou et al. 2021), verknüpft. Dies ermöglicht letztlich die Produktion von C2-Verbindungen in vitro und in vivo aus Formiat als einziger Kohlenstoffquelle.

Für diesen Bereich wurden zwei Publikationen ausgewählt.
Die Plattform BIOPOLYMER umfasst gentechnisch veränderte Bakterienstämme, Vektoren, Promotoren sowie Biosynthesegene zur Synthese von Anthrazyklinen aus dem Actinomyceten Streptomyces coelicolor. Die Plattform soll zur Synthese von Designer-Anthrazyklinanalogen genutzt werden (Wang et al. 2022). Die Hefe Komagataella phaffii (Pichia pastoris) wurde so verändert, dass sie CO₂ als einzige Kohlenstoffquelle nutzen kann und gleichzeitig organische Säuren wie Itaconsäure oder Milchsäure produziert (Baumschabl et al. 2022).

Microbial synthesis of vanillin from waste poly(ethylene terephthalate) (Sadler & Wallace et al. 2021) Die Autoren entwickelten gentechnisch veränderte Escherichia coli, die Kunststoffabfälle in Vanillin umwandeln. Es konnte gezeigt werden, dass das aus Polyethylenglykol (PET) gewonnene Monomer Terephthalat (TA) über einen fünfstufigen enzymatischen Weg, der aus Enzymen von Bakterien (Comamonas sp., Nocardia iowensis und Bacillus subtilis) und einem Säugetier (Rattus norvegicus, Ratte) besteht, in Vanillin umgewandelt wird.

A new-to-nature carboxylation module to improve natural and synthetic CO2 fixation (Scheffen et al. 2021) Die Autoren haben einen neuartigen Reaktionsweg für die CO₂-abhängige Assimilation der C₂-Verbindung Glykolat in den zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel ohne Kohlenstoffverlust entwickelt. Die wenigen natürlichen Wege zur Umwandlung von C₂ in C₃-Metabolite, z. B. die Photorespiration, führen zu Kohlenstoffverlusten. Die Autoren haben den bisher hypothetischen Tartronyl-CoA (TaCo)-Weg entwickelt, einen synthetischen photorespiratorischen Bypass, der eine Alternative zur natürlichen Photorespiration darstellt. Bei diesem Weg wird Glykolat durch eine Drei-Enzym-Reaktion in Glykolyl-CoA, dann in Tartronyl-CoA und schließlich in Glyzerat umgewandelt. Eine gentechnisch veränderte Glykolyl-CoA-Synthetase aus Erythrobacter sp., NAP1, katalysiert die erste Reaktion, während eine Malonyl-CoA-Reduktase aus Chloroflexus aurantiacus den dritten Schritt katalysiert und Tartronyl-CoA in Glyzerat umwandelt. Das Schlüsselenzym des Reaktionsweges, eine Glycolyl-CoA-Carboxylase (GCC), war bislang noch nicht identifiziert. Die Autoren untersuchten Propionyl-CoA-Carboxylasen auf ihr Potenzial als GCC, da diese eine ähnliche Struktur aufweisen. Sie identifizierten die Propionyl-CoA-Carboxylase von Methylorubrum extorquens als Kandidat, führten Mutationen in das Gen ein und veränderten dieses mithilfe einer gerichteten Evolution so, dass ein Protein mit ähnlicher Effizienz wie die natürlich vorkommenden biotinabhängigen Acyl-CoA-Carboxylasen entstand.
Das synthetische GCC-Enzym erwies sich in in vitro-Experimenten in Kombination mit den beiden anderen Enzymen des TaCo-Wegs als funktionell und konnte mit anderen synthetischen CO2-Fixierungszyklen wie dem CETCH-Zyklus (Crotonyl-Coenzym A (CoA)/Ethylmalonyl-CoA/Hydroxybutyryl-CoA) kombiniert werden.

Optogenetic control of plant growth by a microbial rhodopsin (Zhou et al. 2021)
Die Autoren haben ein optogenetisches Kontrollsystem in Pflanzen etabliert, welches deren Wachstum steuern kann. Mikrobielle Rhodopsine sind Proteine, die häufig als optogenetische Werkzeuge exprimiert werden, sich aber in Pflanzen nur schwer exprimieren lassen, da ihnen der essentielle Co-Faktor Retinal fehlt. Die Autoren verwendeten das grünlichtgesteuerte Anionenkanal-Rhodopsin ACR1 aus der einzelligen Alge Guillardia theta in Tabakpflanzen. Um das notwendige Retinal bereitzustellen, wurde die bakterielle ß-Carotin 15,15`-Dioxygenase MbDio als Fusionsprotein mit dem Chloroplasten-Transitpeptid RC2 ko-exprimiert, welches die Akkumulierung von Retinal im Chloroplasten ermöglicht. Die Expression dieser Proteine ermöglichte einen durch grünes Licht induzierten Anionen-Efflux durch die Zellmembran der Pflanzen und eine Depolarisierung des Membranpotentials.
In einem proof-of-principle-Experiment nutzten die Autoren das MbDio-RC2-ACR1-Konstrukt, um die Hypothese zu testen, dass das Wachstum der Pollenschläuche durch eine lokale Anionenkanalaktivierung und dem daraus resultierenden Spannungsgradienten gesteuert wird. Während eine vollständige Beleuchtung zu einem massiven Anionen-Efflux führte, der das Röhrenwachstum entweder nicht beeinflusste oder es stoppte, änderte eine lokale Beleuchtung die Wachstumsrichtung der Röhre weg von der Seite, auf der ACR1 aktiviert war, und bestätigte damit die Hypothese. Diese Arbeit bildet die Grundlage für ein leistungsfähiges Instrument zur Untersuchung der Signalübertragung in Pflanzen und könnte auch die Prüfung der chemisch-elektrischen Signalübertragung ermöglichen.

Miller et al. (2020) entwickelten semi-synthetische Chloroplasten, für die photosynthetisch aktive Membranen in zellgroßen Mikrotropfen enkapsidiert wurden. Um ein Modul für die lichtabhängige Regeneration von Adenosintriphosphat (ATP) und Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP+) zu etablieren, wurden Thylakoidmembranen aus den Chloroplasten von Spinacia oleracea isoliert und auf ihre Fähigkeiten zur lichtabhängigen Reduktion von NADP+ zu NADPH und zur Regeneration von ATP überprüft. Da die Thylakoidmembranen, wie angenommen, NADPH und ATP produzierten, verwendeten Miller et al. diese Membranen nicht nur, um Energie für einzelne Enzymreaktionen zur CO₂-Fixierung bereitzustellen, sondern auch für einen vollständigen synthetischen Stoffwechselzyklus zur kontinuierlichen Fixierung von CO₂. Dieser synthetische Stoffwechselzyklus besteht aus drei Teilen: 1) dem artifiziellen, 16 Enzyme umfassenden Crotonyl-CoA/Ethylmalonyl-CoA/Hydroxybutyryl-CoA (CETCH)-Stoffwechselweg zur in vitro-Fixierung von CO₂, 2) der Glyoxylat/Hydroxypyruvat-Reduktase aus Escherichia coli und 3) einer Crotonase aus Pseudomonas aeruginosa. Zur Herstellung der artifiziellen semi-synthetischen Chloroplasten wurde zusätzlich eine Mikrofluidik-Plattform entwickelt, mit deren Hilfe die metabolisch aktiven Mikrokompartimente automatisch in Wasser-in-Öl-Mikrotröpfchen zusammengesetzt werden können. Die Optimierung der Tröpfchenpräparation führte dabei zu einem komplexen System, das nicht nur wesentliche Eigenschaften der Photosynthese besitzt, sondern auch die Energieproduktion von Systemen mit nur einem Enzym übertrifft. Die hier vorgestellte Arbeit bildet eine wesentliche Grundlage für die Entwicklung eines vollständig und sich selbst erhaltenden synthetischen Organells. - zur Originalliteratur

Reifenrath et al. (2020) nutzen vom endoplasmatischen Retikulum abgeleitete Vesikel zur Kompartimentierung von Enzymen eines Stoffwechselweges in membranumschlossene Organelle. So können mögliche toxische Nebenwirkungen oder unerwünschte Reaktionen, die durch ein heterolog exprimiertes Protein auftreten, vermieden werden. Die drei Enzyme des für Hefe toxischen cis,cis-Mukonsäure (CCM)-Stoffwechselwegs wurden mit einem synthetischen Peptid fusioniert, das die selbstassemblierende Region des Mais-Speicherproteins gamma-Zein (Zera) enthält. Zera kann sowohl in Pflanzen als auch in heterologen Systemen sogenannte Proteinkörper induzieren, die aus dem endoplasmatischen Retikulum oder der Vakuole stammen. Die Zera-induzierten Vesikel mit heterologen CCM-Enzymen wurden in der Hefe Saccharomyces cerevisiae erzeugt und die Funktionalität des Stoffwechselweges in den Vesikeln gezeigt. - zur Originalliteratur

Gleizer et al. (2019) - Die Autoren haben einen E. coli-Stamm hergestellt, der erstmals CO₂ als einzige Quelle zur Produktion von Biomasse nutzt. Dadurch soll die Umwandlung von atmosphärischem CO₂ in Nahrung, Treibstoffe oder Biochemikalien ermöglicht werden. Für die Kohlenstofffixierung nutzen die Bakterien den Calvin-Zyklus, wobei das elektrochemisch produzierte Molekül Formiat (HCOO-) der Energiegewinnung dient. Die Umwandlung von Formiat in ATP treibt den Calvin-Zyklus an, der CO₂ in Zucker und andere organische Moleküle umwandelt. Die Autotrophie wurde durch eine Evolution unter Laborbedingungen erreicht: in einem Chemostat wurde die Xylosekonzentration reduziert, während ausreichend Formiat und CO₂ vorhanden waren. Die Bakterien wurden durch verschiedene Mutationen autotroph, von denen viele in Genen mit metabolischer Verbindung zum Calvin-Zyklus lagen. - zur Originalliteratur

Luo et al. (2019) haben den kompletten Biosyntheseweg für einige komplexe Cannabinoide in der Hefe Saccharomyces cerevisiae generiert. Dazu wurde der Mevalonat-Stoffwechselweg der Hefe modifiziert und es wurden Gene aus der Cannabis-Pflanze sowie Gene aus verschiedenen Organismen in das Hefegenom eingebracht, die für einen Hexanoyl-CoA-Stoffwechselweg erforderlich sind. Die gentechnisch veränderte Hefe kann nun zur kontrollierten industriellen Herstellung von Cannabinoiden genutzt werden. - zur Originalliteratur

South et al. (2019) haben mithilfe eines synthetischen, effektiveren Wegs der Photorespiration das Wachstum und die Produktivität der C3-Pflanze Tabak auf dem Feld verbessert. Besonders bei hohen Temperaturen und Trockenheit stellen C3-Pflanzen (zu denen auch Weizen, Reis und Soja gehören) vermehrt die für Pflanzen toxische Verbindung Glykolat her, welches mittels Photorespiration zu nicht-toxischen Verbindungen abgebaut wird. Dadurch können die Erträge um bis zu 50 % sinken. Durch Einbringen eines synthetischen Glykolatstoffwechselwegs in Chloroplasten und die gleichzeitige Inhibition des natürlichen Photorespirationswegs, konnte die Produktion von Biomasse in homozygoten transgenen Linien um 40 % erhöht werden. - zur Originalliteratur

Engineering Artificial Mitochondria with Self-Amplifying Proton Generation for Autonomous Energy Supply and Metabolic Coupling in Artificial Cells (Fu et al. 2025)

Die Autoren haben eine Nanofabrik für künstliche Zellen erschaffen, die wie ein echtes Mitochondrium eine autonome Energiezufuhr gewährleistet. Dazu wurden die Enzyme Glukoseoxidase (GOx) und Katalase (CAT) gemeinsam in Silica-Nanokapseln (GC@SiO₂) verpackt, deren Membran durch Poren einen Austausch mit kleinen Molekülen erlaubt. GOx wandelt Glukose und Sauerstoff (O₂)in Gluconsäure um, wobei Protonen (H⁺) freigesetzt werden. Die Protonen führen zum Aufbau eines starken Protonengradienten über die Membran. Das als giftiges Nebenprodukt entstehende H₂O₂ wird durch CAT in O₂ und H₂O umgewandelt. Dann erfolgte die Einbettung von GC@SiO₂ in Liposomen, in deren Lipid-Doppelschicht das Enzym ATP-Synthetase (ATPase) eingefügt wurde (GC@SiO₂@Lips-ATPase). Um in einem nächsten Schritt eine ATP-abhängige Synthese von NADH zu ermöglichen, wurden die ATP-Nanofabrik GC@SiO₂@Lips-ATPase sowie die Bausteine der NADH-Herstellung - die Enzyme Hexokinase und Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) sowie NAD⁺ - in künstliche Zellen, sogenannte giant unilamellar vesicles (GUV), eingebracht. In den GUVs wird Glukose unter ATP-Verbrauch durch die Hexokinase in Glukose-6-Phosphat umgewandelt. Dieses Zwischenprodukt wird mittels G6PDH unter Umwandlung von NAD⁺ in NADH weiter verstoffwechselt. Das System ermöglicht also eine kontinuierliche durch Glukose angetriebene ATP-Produktion, welche eine ATP-abhängige NADH-Produktion zulässt und so die oxidative Phosphorylierung von Mitochondrien nachahmt, was den Hauptenergiegewinnungsprozess in aeroben Zellen darstellt. 

Metabolite-Responsive Control of Transcription by Phase Separation-Based Synthetic Organelles (Jerez-Longres et al. 2025)Die Autoren haben das erste synthetische Organell hergestellt, das auf ein bestimmtes Stoffwechselprodukt, hier Pyruvat, reagiert und dadurch die Transkription steuert. Das künstliche Organell basiert auf Tröpfchen (Koazervate), die durch eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung entstehen. Dabei verdichten sich Proteine in wässriger Lösung zu dichten, flüssigen Tröpfchen, in die bestimmte Moleküle eingeschlossen werden können. Die Phasentrennung kann durch die N-terminale intrinsisch ungeordnete Region (IDR) des Proteins fused in farcoma ausgelöst werden. In diesem Fall wird die IDR mit dem bakteriellen Repressor-Protein PdhR (pyruvate dehydrogenase complex regulator) fusioniert. PdhR hat die Eigenschaft, an eine spezifische DNA-Sequenz (pdhR-Operator) zu binden, abhängig davon, ob das Stoffwechselprodukt Pyruvat vorhanden ist oder nicht. In die PdhR-IDR-Tröpfchen werden DNA-Abschnitte eingefügt, welche den pdhR-Operator enthalten, sowie eine DNA-Sequenz, die für das RNA-Aptamer SdBroccoli kodiert. Durch Kontakt zwischen SdBroccoli mit dem Liganden DFBHI kommt es zu einer messbaren hellgrünen Fluoreszenz.  Daraus ergibt sich ein Pyruvat-abhängiger reversibler Schalter mit zwei möglichen Zuständen: 

Aus-Zustand ohne Pyruvat: Das künstliche PhdR-IDR-Protein bildet Tröpfchen aus, die als synthetische Organellen dienen. Ohne Pyruvat besteht eine starke Bindung zwischen der DNA und PdhR, so dass die DNA im Inneren der Tröpfchen vorliegt. Die DNA ist demnach blockiert, sodass sie nicht durch das Enzym T7 RNA-Polymerase abgelesen werden kann. Der Reporter SdBroccoli wird nicht gebildet und es ist kein Fluoreszenzsignal messbar. 

An-Zustand mit Pyruvat: Wird Pyruvat hinzugefügt, bindet es an PdhR, wodurch dieses seine Bindungskraft zur DNA verliert. Die DNA wird aus den Tröpfchen freigegeben und kann durch die T7-RNA-Polymerase abgelesen werden. Die Transkription wird gemessen über die Produktion des SdBroccoli-Reporters, seine Bindung an DFHBI und das daraus resultierende Fluoreszenzsignal.

Diese Arbeit stellt einen wichtigen Schritt zu einer vollsynthetischen Protozelle mit verschiedenen Organellen, die unterschiedliche Funktionen erfüllen, dar.

A synthetic cell phage cycle (Levrier et al. 2025)

Die Autoren stellen den ersten vollständigen, in vitro nachgestellten viralen Infektionszyklus (Adsorption, Genomeintritt, Replikation, Verpackung, Wirtszelllyse) eines T7-Phagen innerhalb künstlicher Zellen vor. Durch den Einsatz von Liposomen mit spezifischen Rezeptoren und zellfreien Genexpressionssystemen (CFE) konnten die Phagen die Zellen infizieren, in ihnen replizieren und anschließend infektiöse Phagennachkommen freisetzen. 

Um stabile Liposomen herzustellen, die eine CFE erlauben, wurde anstatt der häufig verwendeten klassischen Lipopolysaccharide (LPS) eine kürzere Variante benutzt. Diese kürzere „raue“ Variante namens RdLPS hat ein geringeres Molekulargewicht und verbleibt stabil in der künstlichen Membran. Wildtyp-T7-Phagen können nicht an das kurze RdLPS binden, weswegen der T7-Split-S*-Phage mit einer neuen Methode entwickelt wurde. Dieser Phage enthält Mutationen in den Schwanzfasern (tail fibers), eine fadenförmige Proteinstruktur am Schwanzende des Phagen, die zu einer RdLPS-spezifischen Bindung führt. Die Lyse der synthetischen Zellen erfolgt durch einen osmotischen Schock, der durch den Transfer von einem isoosmotischen in ein hypoosmotisches Milieu hervorgerufen wird. Die DNA-Replikation liegt bei einer ein- bis zweifachen Amplifikation, während in einem Bakterienwirt eine 50 bis 300-fache Amplifikation beobachtet wird.

Monodisperse Giant Unilamellar Niosomes as Minimal Synthetic Cells (Luo et al. 2025)

Für die Entwicklung von synthetischen Zellen werden Liposomen, Polymersomen und Fettsäurevesikel verwendet, die als giant unilamellar vesicles (GUVs) zusammengefasst werden. Die Autoren haben als Verbesserung sogenannte giant unilamellar niosomes (GUNs) hergestellt, die aus nicht-ionischen grenzflächenaktiven Substanzen (Tenside) bestehen. GUNs weisen eine hohe Membranfluidität und eine Permeabilität für Moleküle bis zu 500 Da auf, so dass sie keine Transportproteine benötigen, um z. B. Glukose aufzunehmen. Um subzelluläre membranlose Organellen nachzuahmen, wurde eine interne Flüssig-Flüssig-Phasentrennung herbeigeführt. Dazu wurden Polyallylaminhydrochlorid und ATP in die GUNs eingebracht, die bei einem bestimmten externen pH-Wert Tröpfchen (Koazervate) formen und Moleküle aufnehmen können. 

Durch das Einschleusen von aus Gliomzellen extrahierten Mitochondrien sowie der Enzyme Glukose-Dehydrogenase, Gluconat-Dehydrogenase und 2-Keto-3-Deoxygluconat-Aldolase konnte innerhalb der GUNs ATP generiert werden. Das zusätzliche Einbringen von Aktinmonomeren und die Zugabe von Glukose in die äußere Umgebung führte zur Bildung von Aktinfilamenten in den GUNs. Die Studie etabliert GUNs als eine neue Möglichkeit zur Herstellung und Erforschung synthetischer Zellen. 

Die Arbeit bietet eine definierte Plattform zur Untersuchung von Virus-Wirt-Interaktionen und Phagentherapien.

Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells (Tran et al. 2025)

Die Nachbildung der Genexpression (DNA zu RNA zu Protein) in synthetischen Systemen stellt eine große Herausforderung dar. Die Autoren stellen als einen möglichen Lösungsansatz die Abkürzung des Prozesses mit einem einzigen Schritt von Genotyp zu Phänotyp vor. Dazu wurden künstliche Zytoskelette aus einer DNA-Vorlage autonom durch RNA-Origami gebildet, einer Methode aus der Nanotechnologie, bei der ein einzelner langer RNA-Strang so konzipiert wird, dass er sich von selbst in eine komplexe, zwei- oder dreidimensionale Form im Nanometerbereich faltet. Das Zytoskelett wird innerhalb von synthetischen Zellen, den giant unilamellar vesicles (GUVs), unter Verbrauch von Ribonukleosidtriphosphaten ATP, GTP, UTP und CTP (rNTPs) hergestellt. Die Oberflächenmembran der GUVs enthält Poren oder Ionophore, über die die rNTPs und Salze aus dem externen Milieu in die künstliche Zelle gelangen. 

Dabei entsteht ein aktives, energieabhängiges System, das sich kontinuierlich selbst aufbaut und damit im Gegensatz zu klassischen, im Gleichgewicht befindlichen DNA-Origami-Strukturen steht, die nach ihrer einmaligen Selbstassemblierung als weitgehend statische Objekte bestehen bleiben.

Als proof-of-concept wurden RNA-Origami-Nanoröhrchen hergestellt. Dabei falten sich RNA-Origami-Fliesen (origami tiles) bei der Transkription unter isothermen Bedingungen zu mikrometerlangen Nanoröhrchen. Es wurden zudem Mutationen in die DNA-Vorlage eingeführt, die zu einer falschen Faltung und Bildung von Ringen anstatt von Röhrchen führen. Die Vorteile von RNA-Origami gegenüber DNA-Origami sind nach Ansicht der Autoren sind: RNA ist genetisch kodierbar, das heißt die Zellen können ihre eigenen Bausteine in einem aktiven, sich nicht im Gleichgewicht befindlichen Prozess herstellen, während die DNA bei DNA-Origami nur als Baumaterial und nicht als Bauanleitung (template) verwendet wird, Funktionen wie Membranbindung können integriert werden und kleine Änderungen der Sequenzen oder der Helices können zu starken morphologischen Veränderungen führen. Zudem wird nur ein Enzym, die RNA-Polymerase, benötigt anstatt der 150 Gene, die für den Bau eines natürlichen Zytoskeletts benötigt werden. Die hier entwickelte Methode des RNA-Origami ist ein neues Werkzeug, mit denen zukünftig Zellen manipuliert und Fragen der Zellbiologie beantwortet werden können.

Responsive DNA artificial cells for contact and behavior regulation of mammalian cells (Wang et al. 2025)

Die Autoren haben künstliche Zellen entwickelt, die auf DNA basieren und die Fähigkeit haben, Säugetierzellen zu regulieren: stimulable artificial cells designated to regulate mammalian cells, STARMs. Hergestellt werden STARMs durch Temperatur-kontrollierte DNA-Selbstassemblierung. Dabei ordnen sich die STARMs spontan aus DNA-kodierten Ko-Polymeren zu einer zellähnlichen Struktur an, die in künstliche Zelloberflächen und das Zytoplasma nachahmende Kompartimente unterteilt ist. Die Zelloberfläche enthält DNA-basierte Sensoren, die auf bestimmte Reize reagieren können. So können STARMs, je nachdem, welchen Sensor sie tragen, durch Reize wie Ionen oder Licht aktiviert werden. Als Reaktion auf diesen Reiz präsentieren sie dann Liganden, die mit spezifischen Rezeptoren einer Säugetierzelle interagieren können. Durch den Kontakt werden in den natürlichen Zielzellen Signalwege aktiviert. Ein modularer Aufbau der Sensoren ermöglicht die einfache Neukopplung (rewiring) der jeweiligen Reize zu verschiedenen zellulären Antworten (outputs) der Säugetierzellregulation. Als Beispiel für eine Anwendung in vivo wurde ein Mausmodell für Skelettmuskelverletzungen verwendet. Zunächst wurde Gewebe in der Maus über die Verabreichung von Cardiotoxin in den vorderen Schienbeinmuskel geschädigt. In das geschädigte Gewebe wurden STARMs injiziert, die über tief in das Gewebe eindringendes Nahinfrarot (NIR)-Licht aktiviert werden und Aptamer-Liganden freigeben. Die Liganden aktivieren über den fibroblast growth factor receptor 1 die Proliferation von Pax7-positiven Muskelstammzellen. Pax7 ist ein Transkriptionsfaktor und in die Myogenese involviert.  Histologische Untersuchungen zeigten nach drei Zyklen von Injektion und NIR-Bestrahlung eine Regeneration des verletzten Gewebes. Die künstlichen Zellen stellen damit ein innovatives Instrument für die Entwicklung intelligenter Therapeutika in der Biomedizin dar. 

Integrating incompatible tandem photobiocatalysis in artificial cells enables metabolic modulation of natural cells (Wang et al. 2025)

Die Autoren haben eine neue Methode entwickelt, um künstliche Zellen mit Organellen zu erzeugen, die natürliche Zellen bei metabolischen Prozessen als Helferzellen unterstützen. Die künstlichen Zellen wurden als giant unilamellar vesicles (GUVs) konstruiert und enthalten zwei verschiedene, auf Siliziumdioxid basierende Organellen (SiNO), die chemisch nicht miteinander vereinbare Prozesse räumlich voneinander trennen. In solch einem Organell (SiNO@PC) kann beispielsweise die lichtgetriebene (photokatalytische) Regeneration des Ko-Faktors NAD+ stattfinden. In einem anderen Organell (SiNO@ADH/ALDH) erfolgt mittels der Enzyme Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase der Abbau von Ethanol zu Acetat, wobei NAD+ verbraucht wird. Durch die kontinuierliche Ko-Faktor-Regeneration wird der Alkoholabbau aufrechterhalten, während die räumliche Trennung die Enzyme vor den bei der Photokatalyse entstehenden reaktiven Sauerstoffspezies schützt. Die Zellen wurden als Helferzellen für Leberzellen eingesetzt. In in vitro-Versuchen konnte gezeigt werden, dass die künstlichen Zellen den durch den Alkoholstoffwechsel verursachten oxidativen Stress in Mausleberzellen reduzieren können. Die Arbeit zeigt, dass künstliche Zellen durch die Kombination mehrerer funktioneller Kompartimente als metabolische Helferzellen eingesetzt werden können. Das vorgestellte Konzept könnte künftig auch für biokatalytische Anwendungen und zur gezielten Modulation biologischer Prozesse genutzt werden.

Genetically programmed synthetic cells for thermo-responsive protein synthesis and cargo release (Monck et al. 2024)

Die Veröffentlichung beschreibt die Entwicklung einer synthetischen Zelle, die die Proteinexpression durch ein temperatursensitives mRNA-Element steuert. Die Autoren verwendeten ein RNA-Thermometer, das aus einer Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) und einer komplementären anti-RBS-Sequenz besteht, die sich in der 5'-untranslatierten Region zwischen Promotor und dem zu exprimierenden Gen befindet (Jia et al. 2019). Die komplementären Sequenzen lagern sich zu einer Haarnadelstruktur zusammen, die sich erst bei Erreichen einer bestimmten Temperatur öffnet. Dieses System wurde in Kombination mit einem zellfreien Proteinexpressionssystem in giant unilamellar vesicles verwendet. Als proof-of-concept wurde das Porenprotein α-Hämolysin aus Staphylococcus aureus unter Kontrolle des Thermometers exprimiert. Bei einer Temperaturerhöhung synthetisierten die Vesikel das Porenprotein und ein kleines fluoreszierendes Frachtprotein konnte aus den Vesikeln freigesetzt werden. Diese Technik könnte z. B. in der Biomedizin eingesetzt werden, um konfigurierbare synthetische Zellen zu schaffen, die ihre Ladung bei einer bestimmten Temperatur freisetzen.

3D DNA origami pincers that multitask on giant unilamellar vesicles (Zhan et al. 2024)

Die Autoren entwickelten künstliche, programmierbare DNA-Origami-Strukturen, sogenannte DNA-Origami-Zangen (DNA origami pincers, DOPs), mit denen sich die Morphologie von giant unilamellar vesicles (GUVs) gezielt steuern lässt. Die DOPs bestehen aus drei DNA-Bündeln, deren Winkel über den Einbau spezifischer DNA-Stränge gezielt verändert werden kann. Je nach eingestelltem Winkel konnten unterschiedlich starke Verformungen der GUVs induziert werden. Darüber hinaus wurden mehrere DOP-Einheiten auf der Vesikeloberfläche miteinander verknüpft, sodass selbstorganisierte Käfigstrukturen höherer Ordnung entstanden. Während dieses Oligomerisierungsprozesses bildeten sich temporäre Poren in der Membran, durch die kleine Moleküle in das Vesikelinnere gelangten. Die Käfige konnten zudem Lipidfragmente einschließen und sich anschließend von der Membran ablösen. Die Arbeit zeigt, wie DNA-Nanostrukturen künftig zur gezielten Steuerung des Membranumbaus, zum molekularen Transport oder für synthetische zellähnliche Systeme eingesetzt werden könnten.

Künstliche membranlose Organellen und Kompartimente: 

Spatiotemporal regulation of cell fate in living systems using photoactivatable artificial DNA membraneless organelles (Zhang et al. 2024)

Die Autoren entwickelten synthetische, DNA-basierte Koazervate, die als membranlose Organellen fungieren. Diese Strukturen bestehen aus langen Einzelstrang-DNA-Molekülen, die mittels rolling circle amplification (RCA) erzeugt und durch flüssig-flüssig Phasentrennung zu stabilen Koazervat-Tropfen kondensiert wurden. Durch Einlagerung photoaktiver Palladium-Nanopartikel konnten die Koazervate unter Nah-Infrarot-Bestrahlung gezielt Wirkstoffe wie Doxorubicin freisetzen. Die Partikel wurden in vitro hergestellt und über Endozytose in murine Tumorzellen (4T1-Zellen) eingebracht bzw. intravenös in Mäuse injiziert. Dort ermöglichten sie eine lichtabhängige, räumlich und zeitlich gesteuerte Freisetzung des Wirkstoffs und induzierten selektiv den programmierten Zelltod im Tumorgewebe.

Dipeptide coacervates as artificial membraneless organelles for bioorthogonal catalysis (Cao et al. 2024)

Die Autoren entwickelten künstliche Koazervat-Tropfen auf Basis des Dipeptids FF-OMe, einem Diphenylalanin-Derivat (FF), das am C-Terminus eine Methoxygruppe (OMe) trägt. Diese Tröpfchen bilden sich pH-abhängig durch Selbstassoziation und schaffen eine hydrophobe Mikroumgebung, die den Einschluss und die Aktivität von Enzymen sowie hydrophoben Katalysatoren in wässrigen Medien erleichtert. Eingesetzt als Mikroreaktoren, steigerten sie die Effizienz enzymatischer und metallkatalysierter Reaktionen in Wasser deutlich. Durch Kombination mit polyelektrolytbasierten Koazervaten entstanden zellähnliche Mehrkompartiment-Systeme, in denen FF-OMe-Koazervate als funktionelle künstliche Organellen dienten. Mittels chemischer Dimerisierung wurden die Koazervate stabilisiert und erfolgreich in HeLa-Zellen eingebracht. Dort zeigten sie bioorthogonale katalytische Aktivität, ohne die Zellvitalität zu beeinträchtigen. Die Studie zeigt, dass minimalistische Peptid-Koazervate als vielseitige zellkompatible Reaktionsräume und als künstliche Organellen sowohl in zellfreien Systemen als auch in lebenden Zellen vielseitig nutzbar sind.

Co-transcriptional production of programmable RNA condensates and synthetic organelles (Fabrini et al. 2024)

Die Autoren entwickelten ein modulares System zur Erzeugung programmierbarer RNA-Kondensate aus synthetischen RNA-Nanostrukturen. Diese sogenannten RNA-Nanosterne bestehen aus einem einzelnen RNA-Strang, der sich während der Transkription zu einer sternförmigen Struktur mit vier Armen faltet. Über spezifische Basenpaarungen lagern sich diese Nanosterne zu größeren Komplexen zusammen. In vitro sowie in synthetischen Zellen (Wasser-in-Öl-Tropfen) bildeten sie membranlose RNA-Organellen mit definierter Größe, Anzahl und Zusammensetzung. Mittels eingebauter RNA-Aptamere konnten gezielt Fluorophore und Proteine wie EYFP und Streptavidin gebunden werden. Das Einbringen von spezieller linker-RNA veränderte die Wechselwirkungen zwischen den Kondensaten und ermöglichte die kontrollierte Bildung mehrphasiger, strukturierter Aggregate. Die Studie zeigt, dass RNA-Nanotechnologie genutzt werden kann, um zellähnliche Kompartimente herzustellen, die sich für die gezielte Rekrutierung funktioneller Moleküle eignen.

Towards chloroplastic nanofactories: formation of proteinaceous scaffolds for metabolic engineering (Dwyer et al. 2024)

Die Autoren etablierten in den Chloroplasten von Arabidopsis thaliana ein synthetisches bakterielles Mikrokompartiment (BMC). Aufgrund seiner Ähnlichkeit zu einem porösen Kunststoffball, einer ikosaedrischen Hohlstruktur mit regelmäßigen Poren, wurde es als minimal wiffle ball bezeichnet. Für den Aufbau wurden zwei Hüllproteine (BMC-H und BMC-T1) von Haliangium ochraceum so modifiziert, dass sie nach dem Import in die Chloroplasten selbstständig 40 nm große, ikosaedrische Strukturen bilden. Diese Strukturen ähnelten BMC-Hüllen und beeinträchtigten weder das Pflanzenwachstum noch die Chloroplastenfunktion. Die Arbeit zeigt, dass BMCs als stabile, proteingestützte Unterkompartimente auch in Pflanzenzellen assembliert werden können und sich zur gezielten Modulation und Optimierung pflanzlicher Stoffwechselprozesse eignen.

Nucleated synthetic cells with genetically driven intercompartment communication (Ioannou et al. 2024)

Die Autoren entwickelten eine einfache Methode zur Herstellung synthetischer, kernhaltiger Zellen (nucleated synthetic cells, nSynCells) in Form von Vesikel-in-Vesikel-Strukturen. Dabei konnten Kern- und Zytoplasmakompartimente gezielt mit unterschiedlichen biochemischen Komponenten beladen werden. Im inneren Kompartiment wurde mithilfe des kommerziellen PURExpress®-TX-TL-Systems und eines α-Hämolysin-DNA-Plasmids das Porenprotein α-Hämolysin konstitutiv exprimiert. Dieses bildete ausschließlich in der inneren Membran funktionale Poren und ermöglichte so die gezielte Diffusion kleiner Moleküle vom äußeren in das innere Kompartiment. Dort konnten diese Signalmoleküle mit eingeschlossenen Enzymen reagieren und so eine enzymatische Reaktion auslösen. Die Methode kommt ohne Mikrofluidik aus und basiert auf einer leicht zugänglichen Emulsions-Zentrifugation. Nach Angaben der Autoren handelt es sich um die erste Demonstration einer genetisch gesteuerten Kommunikation zwischen Kompartimenten in synthetischen Zellen, bei der die Kommunikation erst durch die in situ-Expression eines Porenproteins ermöglicht wird.

Künstliche Endosymbiose:

Im Jahr 2024 wurden drei Publikationen veröffentlicht, die eine künstliche Rekonstruktion endosymbiotischer Prozesse in eukaryotischen Zellen beschreiben. Dabei gelang es, sowohl Hefezellen als auch Säugetierzellen durch die Aufnahme von Cyanobakterien oder Algenchloroplasten photosynthetisch aktiv zu machen. In Gao et al. wurden genetisch modifizierte Cyanobakterien (Synechococcus elongatus PCC7942), die ATP und Glukose freisetzen können, in Mitochondrien-defiziente Hefezellen eingebracht. Dadurch entstanden stabile Hefe-Cyanobakterien-Chimären, die in der Lage waren, nur mithilfe von Licht und CO₂ zu wachsen. Hu et al. schleusten Synechocystis PCC 6803 zunächst in murine Makrophagen und später in nicht-phagozytische Säugetierzellen ein, wobei sich besonders humane HEK293-Zellen als geeignete Wirte für eine längerfristige endosymbiontische Beziehung erwiesen. In Aoki et al. wurden Chloroplasten der Rotalge Cyanidioschyzon merolae durch Ko-Kultivierung in Hamster-Zellen (CHO-K1) eingebracht, wo sie bis zu zwei Tage ihre innere Thylakoid-Struktur und photosynthetische Aktivität beibehielten.

Artificial cell synthesis using biocatalytic polymerization-induced self-assembly (Belluati et al. 2023) Die Autoren haben eine robuste biokatalytische Polymerisations-induzierte Selbstassemblierung (biocatalytic polymerization-induced self-assembly, bioPISA) für die Erzeugung von sogenannten riesigen unilamellaren Vesikeln (giant unilamellar vesicles, GUVs) entwickelt, um zellähnliche Strukturen zu erzeugen. Myoglobin wurde als Biokatalysator ausgewählt, da es die Atomtransfer-Radikalpolymerisation und die Peroxidase-Aktivität erleichtert und bei einem biologisch relevanten pH-Wert von 7,4 arbeitet. Je nach Verhältnis von Monomer zu Initiator konnten kugelförmige, fadenartige oder vesikuläre Morphologien sowie Stabilität in relevanten wässrigen Lösungen wie Luria-Bertani-Bouillon oder RPMI-1640 beobachtet werden. Moleküle unterschiedlicher Größe, darunter auch Enzyme, konnten verkapselt werden und funktionelle Enzymkaskaden waren nachweisbar. Die Fähigkeit von GUVs, durch Veränderung ihrer Form und Struktur auf äußere Reize zu reagieren, wurde durch Magnesium ausgelöste Veränderungen in der inneren Architektur und der Umwandlung von gelöstem Calciumglycerophosphat in unlösliches Calciumphosphat durch alkalische Phosphatase nachgewiesen, wodurch die Produktion der Mineralmatrix von Knochen durch Osteoblasten imitiert wurde. Verkapselte Plasmide zusammen mit Lysat von E. coli ahmten die Proteinexpression nach, was durch die Produktion von mClover, F-Actin und Calciumphosphat gezeigt wurde. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass bioPISA den Weg für Hybridsysteme ebnen wird, die synthetische Polymere mit natürlichen Molekülen für Anwendungen in der synthetischen Biologie kombinieren.

Cell-sized asymmetric phospholipid-amphiphilic protein vesicles with growth, fission, and molecule transportation (Suzuki and Kamiya 2023) Die Autoren erzeugten zellgroße asymmetrische Phospholipid-amphiphile Proteinvesikel, die aus einer äußeren Lipidmembran und einer inneren Oleosinmembran bestehen. Oleosine sind Pflanzenproteine, die den Ölkörper stabilisieren. Die Insertion des äußeren Membranproteins G in die Membran führte zur Bildung von Nanoporen und zum Transport von Ionen und kleinen Molekülen. Die Zugabe von Lysophosphatidylcholin-Mizellen ermöglichte eine Vergrößerung der Vesikel, was schließlich zu einer Deformation und Spaltung führte. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass diese neuen Vesikel das Potenzial als neuartiges zelluläres Modell haben, das die Vorteile von Lipid- und Proteinmembranschichten einschließlich des Selbstreplikationssystems, der Kommunikation lebender Zellen und komplexer Stoffwechselwege vereinigt.

Für diesen Bereich wurden neun Publikationen ausgewählt.
Synthetische Zellen bestehend aus Liposomen können in einem synthetischen Paarungssystem miteinander interagieren und auf diese Weise verschiedene genetische Schaltkreise aktivieren (Gaut et al. 2022). Ein Drehmotor bestehend aus DNA-Origami wurde in DNA kodiert und konnte sich in einem Reaktionsmix selbst assemblieren. Der Motor ist in seiner Leistung mit natürlichen Motoren wie der ATPase vergleichbar und kann sich in eine Richtung bewegen (Pumm et al. 2022). Große Lipidvesikel wurden als synthetische Zellen zur Produktion von pro-angiogenetischen Faktoren genutzt. In Mäusen konnten diese einen neovaskulatorischen Prozess in Gang setzen (Chen et al. 2022). Eine artifizielle pflanzliche Zellwand, bestehend aus Pektin und Hemizellulose, konnte auf einem synthetischen Polymer und auf einer Lipiddoppelmembran assembliert werden (Notova et al. 2022). Artifizielle Zellen wurden auch auf Basis von Komponenten lebender Zellen aufgebaut. Dazu wurden Koazervate aus einem Polymer und ATP gebildet und zwei Arten von Bakterien im Inneren der Vesikel und auf der Außenhülle gebunden. Nach dem Aufbrechen der Bakterien entstanden artifizielle Zellen mit einer äußeren Bakterien-abgeleiteten Hüllmembran und innenliegenden zellulären Subkompartimenten, in denen Transkription und Translation ausgeführt wurden (Xu et al. 2022). Eine künstliche Zellteilungsmaschinerie wurde mithilfe von stabilen artifiziellen Vesikeln, sogenannten Dendrimersomen, hergestellt. Die Dendrimersomen binden Proteine des MinCDE-Systems, welches wiederum FtsZ-Proteine zur Bildung eines kontraktilen Rings in die Mitte der Zelle dirigiert (Wagner et al. 2022). In einem anderen Ansatz wurde die komplette Zellteilungsmaschinerie von E. coli in Lipidvesikeln rekonstruiert. Dazu wurden ebenfalls Min- und FtsZ-Proteine eingebracht und eine anschließende Formveränderung der Vesikel konnte beobachtet werden (Kohyama et al. 2022). In einem Vesikel wurde ein zelluläres Skelett aus DNA aufgebaut. Die DNA-Filamente wurden in Form rigider Strukturen aufgebaut, sodass sie Ring-ähnliche Formen annahmen, und zudem an der Außenwand der Vesikel verankert und konnten die Vesikel von innen heraus deformieren (Jahnke et al. 2022). Das intrazelluläre Transportsystem bestehend aus einem kolloidalen Motor und selbstassemblierenden Lipidröhren wurde nachgebaut. Die Motoren bewegen sich lichtabhängig auf den Lipidröhren und können eine Fracht in Form eines Lipidvesikels in eine bestimmte Richtung transportieren (Ghellab et al. 2022).

Light-powered reactivation of flagella and contraction of microtubule networks: toward building an artificial cell (Ahmad et al. 2021) Die Autoren versuchten, ein autarkes System mit einer ATP-gesteuerten Bewegung aufzubauen. Um dies zu erreichen, konstruierten die Autoren schaltbare photosynthetische Liposomen, die Bacteriorhodopsin und eine ATP-Synthase aus Escherichia coli enthalten, die bei Lichteinfall ADP in ATP umwandeln kann. Sie koppelten das Modul mit dem aus Chlamydomonas reinhardtii isolierten funktionellen Flagellenmodul und beobachteten die Umwandlung von Licht in mechanische Arbeit. In einem anderen Ansatz wurde das ATP-Regenerationsmodul mit Mikrotubuli und dem molekularen Motor Kinesin-1 verkapselt, und es wurden Kontraktionen des fadenförmigen Netzwerks bei Lichtstimulation beobachtet. Diese Arbeit ist ein weiterer Schritt auf dem Weg zu fortgeschrittenen synthetischen Zellen, die ein breites Spektrum an zytoskelettabhängigen motorischen Funktionen nutzen können.

Programmable microbial ink for 3D printing of living materials produced from genetically engineered protein nanofibers (Duraj-Thatte et al. 2021) Die Autoren entwickelten eine mikrobielle Tinte, die von gentechnisch veränderten E. coli produziert wird und funktionalisiert werden kann. Die Tinte besteht aus Nanofasern, die sich aus bakteriellen curli-Fasern zusammensetzen. Das curli-Faser-Gen CsgA wurde so verändert, dass die curli-Proteine an ihren Enden mit einer Buckel- und einer Loch-Protein-Domäne aus Fibrin fusioniert sind. Diese Domänen ermöglichen die Selbstorganisation zu Nanofasern, die in ein 3D-Hydrogel gedruckt werden können. Das Hydrogel kann funktionalisiert werden, indem man z. B. gentechnisch veränderte E. coli einbaut, die bei Induktion ein Krebsmedikament produzieren, die giftige Chemikalie Bisphenol A binden oder ihr eigenes Wachstum regulieren.

Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles (Litschel et al. 2021) Die Autoren induzierten die Bildung von membrangebundenen Aktinringen in großen unilamellaren Vesikeln, die dem kontraktilen Teilungsring in vielen Zellen ähneln. Die Autoren kapselten G-Aktin mit den Aktin-Bündelungsproteinen Talin und Vinculin ein und verknüpften die Aktin-Filamente über Biotin-Neutravidin-Bindungen mit der Phospholipid-Doppelschicht. Unter Einbeziehung von Muskelmyosin bildeten sich kontraktile Aktomyosinringe, die als ein erster Schritt in Richtung eines Minimal-Divisoms für Protozellen angesehen werden können. Die Ringe können kontraktile Kräfte direkt auf die Membran leiten, was zu einer Formveränderung des Vesikels führt.

Compacting a synthetic yeast chromosome arm (Luo et al. 2021) Die Autoren reduzierten das Genom von Saccharomyces cerevisiae mit Hilfe der LoxP-sites, die im Rahmen des synthetischen Hefegenomprojekts Sc2.0 in synthetische Chromosomen integriert worden waren. Diese sites wurden integriert, um einen Prozess namens SCRaMbLE (synthetic chromosome rearrangement and modification by LoxPsym-mediated evolution) zu ermöglichen, der durch Inversion, Deletion, Duplikation und Translokation bei Expression der Cre-Rekombinase genetisch vielfältige Hefezellen erzeugt. Die Autoren integrierten selektierbare Markergene in die Sequenz zwischen zwei LoxP-sites, sogenannten LoxP-Einheiten (LU), die die Identifizierung von Stämmen ermöglichen, bei denen eine LU verloren gegangen ist. Sie testeten diese Methode mit einem Hefestamm, der den synthetischen linken Arm von Chromosom XII (synXIIL) enthält, und identifizierten einen Stamm, der 26 % (45 kbp) von synXIIL verloren hatte. Eine stärkere Reduktion des Chromosoms synXIIL war schwierig zu erreichen, da einige nicht essentielle Gene in derselben LU wie ein essentielles Gen lokalisiert waren. Um dies zu überwinden, wurde ein episomaler Gen-array mit essenziellen Genen konstruiert, um den Verlust dieser Gene auszugleichen. Auf diese Weise konnten einige LUs mit essenziellen und nicht essenziellen Genen entfernt werden, was zu einem Hefestamm führte, aus dem 58 % (100 kb) von synXIIL entfernt waren. Man geht davon aus, dass die Verkleinerung des Hefegenoms zu besseren Chassis-Organismen für die Produktion von Metaboliten führt, da weniger Energie für unnötige Prozesse verbraucht wird.

Programmable Aggregation of Artificial Cells with DNA Signals (Qiu et al. 2021) Die Autoren untersuchten die programmierbare Kommunikation und Koordination zwischen Vesikeln mithilfe von DNA-Strängen. Sie schufen große und kleine unilamellare Vesikel (giant unilamellar vesicles, GUV und small unilamellar vesicles, SUV), die auf ein DNA-Signal hin miteinander interagieren. Die GUVs besitzen Poren aus DNA-Origami, die mit planaren DNA-Origami-Kappen verschlossen sind. Die Kappen können durch einen toehold-vermittelten Strangaustausch entfernt werden, wodurch die Poren für eine externe hairpin-DNA geöffnet werden. Die hairpin-DNA kann sowohl an die GUV als auch an die SUV binden, jedoch nur, wenn sie von einem im GUV eingekapselten Enzym gespalten wird. Nach der Spaltung diffundiert die hairpin-DNA aus dem GUV heraus und bindet beide Vesikel, so dass die SUVs auf dem GUV aggregieren. Diese Aggregation kann durch einen "Freisetzungsstrang", der komplementär zur transduzierten hairpin-DNA ist, rückgängig gemacht werden. Das hier entwickelte System kann für die Zell-Zell-Kommunikation und das koordinierte Zellverhalten in der synthetischen bottom-up-Biologie verwendet werden.

Biner et al. (2020) erstellten und charakterisierten Energie-regenerierende Nanovesikel (erNV), welche den Prozess der oxidativen Phosphorylierung zur ATP-Regenerierung in Mitochondrien nachahmen. Zur Erstellung der erNVs wurde eine Lipidmischung mit einem Mindestsatz an Atmungsketteneinheiten vermischt, bestehend aus Ubichinon-10 (Q10), ATP-Synthase-Komplex (Ec-F1F0) und dem Komplex I (mito-CI) aus dem Hausrind (Bos taurus) sowie der alternativen Oxidase (AOX) aus Trypanosoma brucei brucei. Dabei sollen die erNVs theoretisch in der Lage sein, die Elektronen aus der Oxidation von Nikotinamidadenindinukleotid (NADH) zu NAD+ zu nutzen, um einen elektrochemischen Protonengradienten (Δp) aufzubauen und dadurch ATP zu synthetisieren. Die experimentellen Daten aus verschiedenen Assays bestätigen, dass sich alle verwendeten Komponenten überwiegend in der funktionsfähigen Orientierung in die Vesikelmembran integrieren. Zudem sind die erNV in der Lage ATP zu produzieren. Im Vergleich mit sub-mitochondrialen oder sub-bakteriellen Vesikeln, welche aus nativen Säuger- bzw. Bakterienmembranen stammen, sind die erNV in der Lage, einen ähnlich hohen Δp aufrecht zu erhalten. Dies bedeutet konkret, dass nur 50 % der Protonen durch Membranundichtigkeiten verloren gehen und eine stabile ATP-Produktion aufrechterhalten werden kann. Diese Arbeit ist das erste Beispiel für ein semi-synthetisches System, bei dem die Oxidation von NADH zur Synthese von ATP verwendet wird. - zur Originalliteratur

Buddingh’ et al. (2020) etablierten ein interzelluläres und allosterisch aktivierbares Kommunikationsnetzwerk in artifiziellen Zellen. Um diese Kommunikationsplattform zu implementieren, wurden zwei unterschiedliche Populationen artifizieller Zellen (giant unilamellar vesicles) hergestellt. Die „Sender“-Zellen reagieren auf ein externes Signal, mit der Bildung von Adenosin-5´-Monophosphat (AMP) als Signalmolekül, welches in das umgebende Medium abgegeben wird. Die „Empfänger“-Zellen sind durch die AMP abhängige allosterische Aktivierung der Glykogenphosphorylase B (GPb) in der Lage, das Signal zu erkennen und zu verstärken. Im direkten Vergleich mit der Hintergrundaktivität bei AMP-Abwesenheit führt schon eine geringe Konzentration von AMP zu einer Konformationsänderung der GPb in den „Empfänger“-Zellen, was zu einer erhöhten Phosphorolyse von Glykogen und einem 80-fachen Anstieg der Nicotinamidadenindinukleotid (NADH)-Produktion führte. Somit wurde erstmals ein allosterisch aktivierbares Kommunikationsnetzwerk erstellt, welches vollständig von der Stoffwechselmaschinerie und kleinen Molekülen als chemische Informationsträger abhängt und zusätzlich in der Lage ist, Signale über eine größere Distanz innerhalb eines Konsortiums artifizieller Zellen zu propagieren. - zur Originalliteratur

Fan et al. (2020) generierten chromosomenfreie Zellen (SimCells) basierend auf Escherichia coli, Pseudomonas putida und Ralstonia eutropha, welche als vereinfachte synthetische Vehikel fungieren. Das Entfernen der Bakterienchromosomen erfolgte, indem mittels der heterologen Endonuklease I-Ceul Doppelstrangbrüche eingeführt wurden und anschließend ein Abbau durch endogene Nukleasen einsetzte. Die so generierten SimCell blieben weiterhin funktionsfähig und stabil. Insbesondere zeigten die SimCells eine stabile Expression von eingebrachten synthetischen Stoffwechselwegen über einen Zeitraum von zumindest zehn Tagen. In einem proof-of-principle-Experiment wurde ein Stoffwechselweg zur Synthese eines Krebsmedikamentes (Brenzcatechin) in die SimCells eingebracht, wodurch die Lebensfähigkeit von Krebszellen in Zellkultur nach Inkubation mit den SimCells signifikant verringert wurde. Somit stellen die SimCells ein synthetisches Werkzeug dar, das z. B. für medizinische Anwendungen programmiert werden kann, um Stoffe ohne unerwünschte Wechselwirkungen mit dem Wirtsgenom sicher zu synthetisieren und zu transportieren. - zur Originalliteratur

Yang et al. (2020) entwickelten Protozellen als minimalistische Kommunikationsmodelle für Zell-Zell-Kommunikationsstudien, basierend auf dem 2019 von Joesaar et al. veröffentlichten Modell. Die Autoren bauten zwei verschiedene Proteinosomen-basierte semipermeable Protozellen, die biotinylierte DNA-Komplexe enthalten, die entweder senden oder empfangen können. Bei Laserbestrahlung wird ein photospaltbarer Nitrobenzyl-linker abgespalten und gibt einen DNA-Strang frei. Dieser DNA-Strang kann die Empfängerzellen erreichen und führt dort zu einer Fluoreszenzantwort. Durch Veränderung der experimentellen Bedingungen zeigten die Autoren, dass die Signalreichweite von mehreren Faktoren wie Dichte und Permeabilität der Empfänger, extrazellulärem Signalabbau, Signalverbrauch und katalytischer Regeneration bestimmt wird. Sie erstellten auch eine Empfängerzelle mit einem UND-Empfänger, der raumzeitlich von zwei Senderzellen aktiviert wurde. - zur Originalliteratur

Berhanu et al. (2019) beschreiben ebenfalls eine Form synthetischer Zellen, die sich selbst mit Energie für die Proteinsynthese versorgen können. Dazu wurden giant unilamellar vesicles mit einem künstlichen Organell konstruiert, welches die Membranproteine Bakteriorhodopsin und F-Typ ATP-Synthase enthält. Über das Bakteriorhodopsin werden Protonen in das Organell gepumpt, welche dann von der ATP-Synthase zur ATP-Produktion genutzt werden. Bei Zugabe eines modifizierten Transkriptions-Translationssystems kann das produzierte ATP als Substrat für mRNA, zur Phosphorylierung von GDP und als Energie für die Aminoacylierung der tRNA genutzt werden. Das System ist so in der Lage, Bakteriorhodopsin und Untereinheiten der ATP-Synthase de novo zu synthetisieren und somit die photosynthetische ATP-Produktion in den artifiziellen Organellen zu erhöhen. - zur Originalliteratur

Diederichs et al. (2019) - Die Autoren entwickelten Moleküle für die Bildung von Nanoporen mit einem Durchmesser von 20,5 nm und einer Höhe von durchschnittlich 31,5 nm, durch die auch gefaltete Proteine wie fluoreszierende Proteine transportiert werden können. Die Nanoporen bestehen aus quadratisch angeordneten DNA-Duplexen, die zur Insertion in die Membran mit Cholesterol-Lipidankern versehen sind. So entstehen 50 nm2 große Poren, die in artifiziellen Zellen eingesetzt werden könnten. - zur Originalliteratur

Ghosh et al. (2019) - Während des Substratumsatzes kann bei vielen Enzymen eine diffuse Bewegung beobachtet werden, die sich mit der Erhöhung der Substratkonzentration noch verstärkt. Diese Tatsache ausnutzend, produzierten Ghosh et al. Phospholipidvesikel, die als Transmembranmolekül die Na+/K+-ATPase enthielten. Anschließend wurden diese Vesikel unter physiologischen Bedingungen in Kultur getestet und zeigten eine gerichtete Bewegung, gefolgt von einer randomisierten Reorientierung. Diese Vesikel stellen einen ersten Schritt in Richtung autonomer Nanovesikel dar und können z. B. als Transportvesikel für Biomoleküle genutzt werden. - zur Originalliteratur

Zur Weiterentwicklung von synthetischen Zellen wurden mechanosensitive Mechanismen für verschiedene Anwendungen durch zwei Forschergruppen wie folgt implementiert:

Garamella et al. (2019) konstruierten Protozellen, welche auf Umwelteinflüsse reagieren und selbständig einem Reiz entgegenwirken können. Hierfür wurden synthetische Zellen mit einer Phospholipidmembran hergestellt, welche durch Inkorporation von MscL-Ionenkanälen mechanosensitiv sind. Der Intrazellularraum der synthetischen Zelle enthält sowohl Plasmide zur Expression eines bakteriellen Zytoskelettproteins (MreB) als auch ein in vitro-Transkriptions- und Translationssystem. Durch Veränderung der äußeren Umweltbedingungen, hin zu einem hypoosmolarem Exterieur, kommt es zum mechanischen Stress der Membran und somit zu einer Porenbildung durch die MscL. Daraufhin strömt ein im extrazellulären Medium befindliches Regulatormolekül ein, welches die Expression des MreB ermöglicht. Im Anschluss migriert MreB zur Membran und erhöhte dort die mechanische Robustheit. Hiermit konnte ein adaptives synthetisches Zellsystem erstellt werden, welches sich gegenüber osmolarem Stress widerstandsfähig zeigt. - zur Originalliteratur

Hindley et al. (2019) etablierten einen mechanosensitiven Signalweg, welcher auf dem sPLA2-Membran-MscL-Netzwerk von Charalambous et al. (2012) basiert. Dabei diente die kalziumabhängige lösliche Phospholipase A2 (sPLA2) als Katalysator zur Synthese von Lysophosphatidylcholin, welches in die Membran von artifiziellen Zellen eingebaut wird. Dies wiederum führt zu einer Veränderung in der Membranmechanik und zur Öffnung des Ionenkanals MscL. Darauf aufbauend erstellten Hindley et al. artifizielle Zellen, welche sowohl mechanosensitive Vesikel mit dem Fluoreszenzfarbstoff Calcein als auch inaktivierte sPLA2 enthielten. Die anschließende extrazelluläre Zugabe von alpha-Hämolysin führte zur Bildung von Poren in der äußeren Membran, nachfolgend zum Kalzium-Influx und zur Aktivierung der sPLA2. Die veränderte Mechanik der Vesikelmembran und die daraus resultierende Öffnung des MscL wurde mittels steigender Calcein-Fluoreszenz nachgewiesen. Somit konnte ein kontrollierter Kalziumeinstrom für eine zukünftige Signaltransduktion in artifiziellen Zellen etabliert werden. - zur Originalliteratur

Joesaar et al. (2019) entwickelten Konsortien synthetischer Protozellen, die über orthogonale Kanäle miteinander kommunizieren. Die Protozellen besitzen eine Membran aus Proteinosomen, die für kurze (< 100 Basen) einzelsträngige DNA (ssDNA)-Moleküle permeabel ist und die in den Zellen enthaltene DNA vor einem Abbau im Zellkulturmedium schützt. Die Zellen kommunizieren über ssDNA miteinander, indem eine Zelle eine input-ssDNA abgibt, welche in der nächsten Zelle eine andere ssDNA ersetzt, deren Sequenz einen kleinen mismatch aufweist. Diese zweite ssDNA kann dann in die nächste Zelle diffundieren. Auf diese Weise können mehrere Zellpopulationen auch bidirektional miteinander kommunizieren. - zur Originalliteratur

Venetz et al. (2019) beschreiben die Synthese eines minimalen bakteriellen Genoms des Modellorganismus Caulobacter ethensis. Dazu wurden bereits bekannte essentielle Gene des Bakteriums mithilfe eines Algorithmus neu zusammengefügt, wobei die bestehende Abfolge der Gene und deren Orientierung beibehalten wurde. Zudem wurde das Genom für die Synthese optimiert. Dazu wurden mithilfe von 10.172 Basensubstitutionen 1233 repeats, 93 homopolymere Regionen, 4342 Regionen mit hohem GC-Gehalt sowie 1045 Endonuklease-Restriktionsschnittstellen entfernt. Zudem wurden 123.141 weitere Basensubstitutionen in proteinkodierende Regionen inseriert. Das synthetische Genom (C. eth-2.0) hat eine Größe von 785 kb und enthält 676 proteinkodierende, 54 nicht-kodierende und 1015 intergenische Sequenzen. 56,1 % aller Kodons waren durch synonyme Kodons ersetzt, sodass 87,4 % aller alternativen ORFs, 95,3 % aller vorhergesagten internen Transkriptionsstartsites und 76,7 % aller ribosome stalling-Motive entfernt wurden. Da 81,5 % der Gene von C. eth-2.0 funktional waren, scheint bei diesen Genen die Primärsequenz der mRNA, die Sekundärstruktur oder der Kontext eines Kodons im Genom keinen signifikanten Einfluss auf die biologische Funktion des kodierten Proteins zu haben. - zur Originalliteratur

Niederholtmeyer et al. (2018) beschreiben synthetische Protozellen mit einer porösen Membran und einem primitiven „Zellkern“. Der „Zellkern“ ist eine aus Tonmineralien hergestellte Hydrogelkammer und enthält die zelluläre DNA. Die synthetischen Zellen können über ihre poröse Membran alle Komponenten eines zellfreien Transkriptions-Translationssystem aufnehmen und die DNA ihres „Zellkerns“ exprimieren. Die gebildeten Proteine können dann in benachbarte synthetische Zellen wandern, sodass zwei Zellen miteinander über Proteine kommunizieren und ein artifizielles quorum sensing aufbauen können. - zur Originalliteratur

Shao et al. (2018) haben alle 16 Chromosomen der Bäckerhefe S. cerevisiae zu einem sog. Super-Chromosom kombiniert, in dem die nicht erforderlichen Telomere und Zentromere sowie 19 lange repetitive Sequenzen mithilfe von CRISPR-Cas9 entfernt und die übrigen Chromosomen-Abschnitte fusioniert wurden. Die Forscher um Luo et al. (2018) verfolgten dasselbe Ziel und gelangten über einen ähnlichen Ansatz zu einer Hefe, deren Genom nur noch aus zwei Chromosomen besteht. Hintergrund der Experimente war die Beobachtung, dass die Anzahl der Chromosomen in Eukaryoten eher willkürlich und unabhängig von der Menge genetischer Information zu sein scheint. Die Reduktion der Chromosomenzahl hatte in der Tat nur geringe Auswirkungen auf die meisten Eigenschaften der Hefe. Diese zeigten einen ähnlichen Phänotyp und ein nahezu identisches Transkriptom. Lediglich das Wachstum war in der Hefe mit nur einem Chromosom verlangsamt. Die Bildung von Ascosporen als Teil der sexuellen Reproduktion war für beide Stämme deutlich reduziert. Durch die Genomumorganisation wurde erreicht, dass sich der neue Organismus nicht mehr mit dem Wildtyp kreuzen kann und er somit reproduktiv isoliert ist. Hierdurch ist das klassische Kriterium für die Zuordnung zu zwei verschiedenen biologischen Spezies erfüllt. - zur Originalliteratur: Shao et al. (2018), Luo et al. (2018)

Design and evolution of artificial enzyme with in-situ biosynthesized non-canonical amino acid (Huang et al. 2025)

Die Autoren präsentieren eine neue Methode, um künstliche „Designer“-Enzyme direkt in lebenden Zellen zu erzeugen und zu optimieren. Die Methode besteht aus einer Kombination von in situ-Biosynthese nicht-natürlicher Aminosäuren (ncAA) und genetischer Code-Erweiterung. So wurde ein S-funktionalisiertes, Cystein-abhängiges Enzym (SFC-Enzym) mit S-(4-aminophenyl)-L-Cystein (pAPhC) im Bakterium Escherichia coli entwickelt. Das Enzym katalysierte nach drei Zyklen gezielter Evolution eine Friedel-Crafts-Alkylierungsreaktion mit hoher Ausbeute und Selektivität und wies im Vergleich zu bekannten Enzymen eine umgekehrte Stereoselektivität auf. Die Friedel-Crafts-Alkylierung ist eine der wichtigsten Reaktionen in der organischen Chemie und dient dazu, Alkylgruppen an einen aromatischen Ring (z. B. Benzol oder Indol) anzufügen. Mit dem entwickelten Designer-Enzym konnte diese in der Natur nicht bekannte katalytische Funktion erstmals effizient in lebenden Zellen realisiert werden. 

Efficient genetic code expansion without host genome modification (Costello et al. 2024)

Die Verwendung von vier-Basen-Kodons ist eine Strategie zur Erweiterung des genetischen Codes mit nicht-nativen Kodons, die aber oft weniger effizient ist als die Dekodierung von drei-Basen-Kodons. Die Autoren entwickelten eine Strategie zur Verbesserung des Einbaus nicht-kanonischer Aminosäuren (ncAA) in Proteine, ohne die Escherichia coli-Wirtszelle zu verändern. Sie verwendeten einen superfolder-GFP-Reporter, bei dem das permissive Y151 durch ein vier-Basen-Kodon ersetzt wurde. Dieses Design lässt nur dann eine GFP-Expression zu, wenn das vier-Basen-Kodon durch eine tRNA gelesen wird. Zusätzlich wurde die Kodonverwendung der fünf benachbarten Aminosäurereste upstream und downstream modifiziert. Mit diesem Ansatz konnte gezeigt werden, dass die vier-Basen-Dekodierung besonders gut funktioniert, wenn sich 3´ zum vier-Basen-Kodon ein häufig genutztes Kodon befindet. Zudem können off-target-frameshifts vermieden werden, wenn häufig genutzte Kodons verwendet werden. Darüber hinaus wurden 12 zueinander orthogonale Transfer-RNA (tRNA)-Synthetase-Paare identifiziert, um ncAA in Proteine zu integrieren. Fünf davon wurden so weiterentwickelt, dass sie verschiedene ncAAs an orthogonalen vier-Basen-Kodons integrieren können. Mithilfe dieser Strategien bauten die Autoren eine in vivo-Biosyntheseplattform auf, um > 100 naturfremde makrozyklische Peptide mit bis zu drei einzigartigen ncAA zu erzeugen. Dies könnte ein Schritt in Richtung der programmierbaren Herstellung chemisch vielfältiger Polymere sein.

Adding α,α-disubstituted and β-linked  monomers to the genetic code of an organism (Dunkelmann et al. 2024)

Um nicht-kanonische Monomere (ncMs, nicht-kanonische Aminosäuren oder andere Moleküle, die normalerweise nicht in Proteine eingebaut werden) in Proteine einzubauen, muss eine orthogonale tRNA-Synthetase das ncM an eine orthogonale tRNA acylieren, die dann vom Ribosom für die Translation gebunden wird. ncMs sind oft schlechte Ribosomensubstrate und können nicht effizient an die orthogonale tRNA acyliert werden. Die Autoren entwickelten eine Strategie zur Identifizierung von tRNA-Varianten, die zur Einbindung von ncM fähig sind. Sie etablierten eine Methode, mit der der Acylierungsstatus einer tRNA festgestellt werden kann, wodurch bestimmt werden kann, ob die ncM auf die tRNA geladen ist. Als Nächstes wurde eine Fusions-RNA aus einer gespaltenen tRNA und der mRNA einer Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (PylRS) erstellt, die es ermöglichte, die mRNA-Synthetase-Sequenz mit ihrer Aktivität zu korrelieren. Um neue PylRS-Varianten zu identifizieren, die zur Einbindung von ncMs fähig sind, wurden große Bibliotheken dieser Hybrid-RNAs mit mutierten Resten im aktiven Zentrum von PylRS erstellt und mit ncMs kultiviert, die entweder nicht translatierbar oder schlechte Ribosomensubstrate sind. Die acylierten Hybrid-RNAs wurden dann isoliert und revers transkribiert, um das für die Acylierung verantwortliche PylRS-Gen zu erhalten. Mit diesem Ansatz wurden PylRS für die ncM-Klassen der β-Aminosäuren, α,α-disubstituierten Aminosäuren und β-Hydroxysäuren identifiziert und einige davon in Proteine eingebaut. Dieser Einbau neuer ncMs in Proteine könnte bei der Herstellung neuer arzneimittelähnlicher Moleküle in lebenden Zellen nützlich sein.

Designing artificial fluorescent proteins and biosensors by genetically encoding molecular rotor-based amino acids (Hu et al. 2024)

Fluorophore in fluoreszierenden Proteinen wie GFP werden durch die primäre Aminosäuresequenz kodiert, die sich bei der Proteinfaltung zu einer fluoreszierenden Rotorstruktur faltet, gefolgt von einer spontanen Zyklisierung. Die Autoren entwickelten fluorogene nicht-kanonische Aminosäuren mit dieser Rotorstruktur, die sogenannten fluoreszierenden molekularen Rotoraminosäuren (FMR-AAs). Wenn diese über einen erweiterten genetischen Code in ein Protein integriert werden, verwandeln die Fluorophore Proteine in fluoreszierende Proteine. Die Technik wurde verwendet, um Biosensoren in Säugetierzellen zu etablieren, die beispielsweise Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration oder Proteininteraktionen erkennen. Auf diese Weise können maßgeschneiderte fluoreszierende Proteine für molekulare Visualisierungen und Untersuchungen erstellt werden.

Expanding the substrate scope of pyrrolysyl-transfer RNA synthetase enzymes to include non-α-amino acids in vitro and in vivo (Fricke et al. 2023) Die Autoren beschreiben das erste Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Enzym, das α-Thiosäuren und α-Carbonsäuren akzeptiert, die die Bildung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen im Ribosom unterstützen könnten, wodurch die Anzahl der Nicht-L-α-Aminosäuren erhöht wird, die in vivo in Proteine eingebaut werden können. Die Struktur der Variante MaFRSA der Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (MaPylRS) von Methanomethylophilus alvus wurde untersucht und zeigte die Fähigkeit, die Biosynthese von Proteinen mit internen aromatischen α-Hydroxysäure-Monomeren zu unterstützen. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass Ribosomen, die in Kombination mit synthetischen Genomen zur Bildung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen fähig sind, die Voraussetzungen für die schablonengesteuerte Biosynthese einzigartiger Hybrid-Biomaterialien und sequenzdefinierter Polyketid-Peptid-Oligomere schaffen würden.

Für das Jahr 2022 wurden keine Veröffentlichungen aus dem Bereich Xenobiologie zur Publikation auf der ZKBS-Homepage ausgewählt.

Multiplex suppression of four quadruplet codons via tRNA directed evolution (DeBenedictis et al. 2021) Die Autoren nutzten gerichtete Evolution, um einen kleinen Satz von Quadruplett-tRNAs (qtRNAs) zu etablieren, die Aminosäuren unter Multiplex-Bedingungen einbauen. Durch die Einführung eines Quadruplett-Codons als Reporter in das β-Galactosidase-Gen wurden Codon-Anticodon-Interaktionen zunächst in E. coli validiert. Mit dieser Strategie wurden 24 qtRNAs identifiziert, die das eingeführte Codon dekodieren und infolgedessen eine bestimmte Aminosäure auf das Protein laden. Die identifizierten qtRNAs wurden durch gerichtete Evolution in Phagen weiterentwickelt. Die Phagen konnten sich nur vermehren, wenn ein bestimmtes Quadruplett-Codon entschlüsselt wurde. Die Autoren zeigten die Translation von sechs aufeinanderfolgenden UAGA-Codons sowie die Translation von vier verschiedenen Quadruplett-Codons in ein und demselben Protein. Die Arbeit ist ein weiterer Schritt auf dem Weg zu einem ausschließlichen Quadruplett-Codon-Translationssystem.

Sense codon reassignment enables viral resistance and encoded polymer synthesis (Robertson et al. 2021) Die Autoren haben sense-Codons freigemacht, um mehrere verschiedene nicht-kanonische Aminosäuren (ncAAs) einzubauen. Mit Hilfe eines veränderten tRNA-Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares (aaRS) können ncAAs als Reaktion auf ein bestimmtes Codon eingebaut werden. Die Autoren verwendeten den von Fredens et al. entwickelten E. coli-Stamm Syn61, in dem zwei Serin-Codons (TCG und TCA) sowie das Stopp-Codon UAG gegen synonyme Codons ausgetauscht wurden, und entwickelten den Stamm so weiter, dass die tRNAs und der releasefactor 1, der TCG, TCA und TAG dekodiert, entfernt wurden. Durch die Deletion der tRNAs und des release factor wurden die Zellen resistent gegen Phagen, die diese drei Codons in ihrem Genom aufweisen. Die Codons wurden zudem für den Einbau von drei verschiedenen ncAAs in ein Protein neu zugeordnet. Der Einbau von ncAAs in Proteine kann für die Entwicklung neuer Biomaterialien oder Biotherapeutika genutzt werden.

Chen et al. (2020) haben einen Escherichia coli-Stamm generiert, der autonom 5-Hydroxytryptophan (5HTP) als 21. nicht-kanonische Aminosäure (ncAA) biosynthetisiert und in Proteine einbaut. Dies stellt ein Werkzeug für die Evolution neuartiger Proteine dar, die ncAAs enthalten, und kann zur Generierung neuer therapeutischer Proteine genutzt werden. Um 5HTP als ncAA in Prokaryoten nutzen zu können, musste die Hydroxylierungsmaschinerie von Tryptophan (dem Substrat für die 5HTP-Bildung) in E. coli eingeführt werden. In einem ersten Schritt wurde dafür ein Plasmid generiert, das eine spezifische Hydroxylase (z. B. XcP4H aus Xanthomonas campestris), einen künstlichen Recyclingweg für den Hydroxylase-Kofaktor Tetrahydromonapterin (MH4) und eine Expressionskassette für das grün fluoreszierende Protein (GFP) mit einem Amber-Stoppkodon an Position Tyr151 enthält. Ein zweites Plasmid, das eine modifizierte Tryptophanyl-tRNA-Synthetase (ScTrpRS)/tRNATrp aus Saccharomyces cerevisiae enthält, stellt die bioorthogonale Maschinerie zum Einbau von 5HTP am Amber-Stoppkodon bereit. Beide Plasmide wurden in E. coli transferiert, es kam zu einer von der Hydrolase und den MH4-Recycling-Genen abhängigen Expression von GFP, wobei 5HTP effizient und spezifisch eingebaut wurde. Als proof-of-concept verwendeten Chen et al. den E. coli-Stamm zur Expression des 5HTP-haltigen singe-chain variable fragment (scFv), eines Antikörperfragments gegen den humanen epidermalen Wachstumsfaktors 2 (HER2). - zur Originalliteratur

Fischer et al. (2020) identifizierten weitere unnatürliche Kodons, die in den von Zhang et al. (2017) erstellten, semi-synthetischen Organismus (SSO) inseriert werden. Da der SSO (Escherichia coli) in der Lage ist, das unnatürliche Basenpaar (UBP) NaM und TPT3 in verschiedenen Sequenzkontexten zu replizieren und zu transkribieren, nutzten Fischer et al. dieses UBP, um eine systematische Analyse von unnatürlichen Kodons durchzuführen. Durch die Insertion des NaM/TPT3-Basenpaars können neue Kodons erzeugt werden. Um diese unnatürlichen Kodons zu testen, wurden GFP-exprimierende Plasmide erstellt, bei denen NaM oder TPT3 an erster, zweiter oder dritter Stelle des Kodons 151 inseriert wurde und welche eine tRNA mit den entsprechenden Antikodons zum Einbau einer nicht-kanonischen Aminosäure (ncAA) enthalten. Diese Plasmide wurden in E. coli eingebracht. Anhand der GFP-Fluoreszenz wurden neun Kodon-Antikodon-Paare identifiziert. Alle waren stabil in der genomischen DNA kodiert und konnten erfolgreich in eine mRNA übersetzt bzw. von ihrer spezifischen tRNA gebunden werden, wodurch eine effiziente Dekodierung am Ribosom vermittelt werden konnte. Darüber hinaus wurden drei dieser Kodon-Antikodon-Paare weiter charakterisiert, indem gleichzeitig ihre Kodons in das GFP-Gen inseriert und ihre Antikodons in tRNAs in E. coli eingebracht wurden. Die drei Kodons waren orthogonal zueinander und konnten gleichzeitig innerhalb des SSO dekodiert werden. Dadurch ist ein Organismus entstanden, der erstmals in der Lage ist, 67 Codons zu dekodieren. - zur Originalliteratur

Flamme et al. (2020) haben unnatürliche Basenpaare (UBP) enzymatisch auf der Basis von Metall-Ionen erzeugt. Diese Metall-Basenpaare sind orthogonal zu den natürlichen Watson-Crick-Basenpaaren und integrieren sich leicht in die Struktur der DNA. Der Einbau von Basenpaaren mit Metallionen erweitert die chemische Vielfalt von DNA und RNA und kann für neuartige Nanomaterialien genutzt werden. Für die enzymatische Synthese eines silbervermittelten UBP verwendeten die Autoren zwei synthetische Analoga: das imidazolhaltige Nukleosid dIM^C und das 6-Pyridylpurin-Nukleosid dPur^P. Dieses silbervermittelte UBP (dIM^C - Ag^I - dPur^P) wurde dann mit Hilfe eines zweistufigen Syntheseprotokolls in einen DNA-Duplex eingebaut. - zur Originalliteratur

Lee et al. (2020) untersuchten, wie der Einbau von nicht kanonischen Aminosäuren mit einem verlängerten Kohlenstoff-Rückgrat (Aminosäure-Analoga) verbessert werden kann, und machten so einen weiteren Schritt Richtung Synthese von nicht-kanonischen sequenzdefinierten Polymeren. Das Beladen der tRNA mit einem Aminosäure-Analogen ist aktuell schwierig umzusetzen und wurde mithilfe des Flexizym-System (Fx, ein Aminoacyl-tRNA-Synthetase-ähnliches Ribozym) untersucht. Es zeigte sich, dass die Beladung von Aminosäuren mit langkettigen Kohlenstoffstrukturen durch eine intramolekulare Lactambildung behindert wurde. Um dies zu umgehen, wurde die intramolekulare Lactambildung durch sterische Restriktion der Amino- und aktivierten Esterfunktionalitäten verhindert. Diese molekulare Architektur nutzt dazu einen starren spacer wie Vinyl oder eine zyklische Struktur in der zentralen Region der Aminosäure und erhöht so die Gesamtladeeffizienz des Fx-Systems. Um diese Erkenntnisse auf eine natürlichere Protein-Synthese zu übertragen, wurden die Fx-geladenen tRNAs in einem zellfreien Proteinsynthese-System eingesetzt, um die Aminosäure-Analoga während der Proteinsynthese am C- und N-Terminus einzubauen. Es konnte gezeigt werden, dass jedes Substrat, das auf tRNAs geladen werden konnte, erfolgreich durch Wildtyp- oder technisch modifizierte Ribosomen in ein Peptid eingebaut wurde. - zur Originalliteratur

Yang et al. (2020) haben die Studien von Eremeeva et al. (2017) erweitert, die die Amplifikation von DNA mit vier nicht-kanonischen Basenpaaren (DZA) zeigten. Diese chemischen Modifikationen können die Stabilität und Vielseitigkeit von Nukleinsäuren erhöhen, z. B. in der biomedizinischen Forschung. Die Autoren testeten vollständig basenmodifizierte RNA (RZA) bei der Replikation, Transkription und reversen Transkription und etablierten den Informationsfluss zwischen natürlicher und unnatürlicher genetischer Information. In vitro konnte die PCR-synthetisierte DZA in RZA oder in unmodifizierte RNA transkribiert und in DNA oder DZA revers transkribiert werden. In vivo wurde DZA in Escherichia coli transkribiert und in das rot fluoreszierende Protein mTangerine translatiert. - zur Originalliteratur

Calles et al. (2019) erstellten einen genetischen fail safecode, der von der natürlichen Translationsmaschinerie gelesen werden könnte und einen protektiven Effekt gegenüber Spontanmutationen aufweist. Dabei wird jede Aminosäure nur durch ein einziges Kodon kodiert, alle anderen Kodons für diese Aminosäure wären nicht translatierbare „Null-Kodons“. Idealerweise soll dabei die Mutation eines dieser sense-Kodons nicht zu einem anderen sense-Kodon führen. Dies ist bei einem 3-Basen-Kode nur möglich, wenn lediglich 16 Aminosäuren kodiert werden. Wird allerdings ein 4-Basen-Kode verwendet, können alle 20 Aminosäuren und zusätzliche, nicht natürliche Aminosäuren kodiert werden, ohne dass eine Mutation in einem anderen sense-Kodon resultiert. In einer ersten Anwendung des fail safe code wurde ein in vitro-Transkriptions- und Translationssystem genutzt. In diesem System wurden alle natürlichen tRNAs depletiert und durch 20 tRNAs ersetzt, welche die 20 Kodons des fail safe code erkennen. Somit waren keine tRNAs vorhanden, die „Null-Kodons“ erkennen können. - zur Originalliteratur

Hoshika et al. (2019) haben den genetischen Code um vier synthetische Nukleotide erweitert und so ein Acht-Buchstaben-Alphabet generiert. Die synthetische DNA verhält sich weitestgehend wie die natürliche DNA: Sie bildet eine Doppelhelix aus, in der die Interaktion über Wasserstoffbrückenbindungen erfolgt, und kann in RNA transkribiert werden. Organismen, die dieses Alphabet nutzen und stabil weitervererben wurden noch nicht generiert. - zur Originalliteratur

Kneuttinger et al. (2019) - Die Autoren haben nicht-natürliche Aminosäuren (nnAminosäuren) in das Bienzym Imidazol-Glycerolphosphatsynthase inseriert, um die Aktivierung des Enzyms über Licht zu erreichen. Im ursprünglichen Mechanismus erfolgt die Aktivierung der HisH-Untereinheit ausschließlich durch die Bindung eines Substrates an die HisF-Untereinheit. Durch den Einbau der drei lichtempfindlichen nnAminosäuren Phenylalanin-4'-Azobenzen, o-Nitropiperonyl-O-Tyrosin und Methyl-o-Nitropiperonyllysin in die substratbindende Enzymuntereinheit wurde eine lichtinduzierbare und reversible Erhöhung der Aktivierung der HisH-Aktivität erreicht, sodass eine räumliche und zeitliche Kontrolle der Enzymaktivität durch Licht ermöglicht wird. - zur Originalliteratur

Koh et al. (2019) stellten auxotrophe Escherichia coli-Bakterien her, bei denen die β-Untereinheit des DNA-Polymerase III-Holoenzyms an Position 273 anstelle eines Leucins das synthetische p-Benzoylphenyl-Alanin (pBzF) enthält und die daher nur in Anwesenheit von pBzF im Medium wachsen können. Die auch als sliding clamp bezeichnete β-Untereinheit ist in Gram-negativen Bakterien stark konserviert, sodass der auxotrophe Stamm eine nicht detektierbare escape frequency aufweist. Die beschriebene Auxotrophie kann zudem leicht auf andere Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa oder Acinetobacter baumanii übertragen werden, um konditional lebensfähige Lebendimpfstoffe gegen diese Krankenhauskeime herzustellen. - zur Originalliteratur

Reinkemeier et al. (2019) arbeiten an der orthologen Translation des Amber-Stopp-Kodons (TAG). Um dieses Kodon zum Einbau einer nicht-kanonischen Aminosäure in ein Protein nutzen zu können, sind eine orthogonale tRNA und eine tRNA-Synthetase nötig. Dieses tRNA/tRNA-Synthetase-Paar wurde mit einer mRNA, deren Amber-Stopp-Kodon rekodiert werden soll, in einem synthetischen Organell in räumliche Nähe gebracht. Dazu wurden das tRNA/tRNA-Synthetase-Paar sowie eine RNA-Bindedomäne mit einem sogenannten assembler-Protein fusioniert. Dies kann z. B. ein Protein sein, welches innerhalb der Zelle eine Phasentrennung durchläuft oder ein Kinesin, das sich räumlich an den Plusenden der Mikrotubuli anreichert. In dem künstlichen Organell finden sich somit sowohl das tRNA/tRNA-Synthetase-Paar als auch eine mRNA mit einer Erkennungssequenz für die RNA-Bindedomäne wieder, sodass die Neukodierung des Stopp-Kodons nur in ausgewählten mRNAs erfolgt. - zur Originalliteratur

Swenson et al. (2019) haben ein synthetisches, bilinguales Biopolymer entwickelt, welches die Eigenschaften einer Aminosäuresequenz und die einer Nukleotidsequenz in einem einzigen Peptid-Nukleinsäure (PNA)-Gerüst vereint. Der PNA-Strang besitzt dabei Aminosäure-ähnliche Seitenketten, die aufgrund ihrer Anordnung ein ähnliches Aggregations- bzw. Faltungsverhalten wie ein Peptid aufweisen. Zusätzlich trägt der PNA-Strang aber auch Nukleotide in einer bestimmten Sequenzfolge, die durch komplementäre DNA oder RNA gebunden werden können. Als Anwendung zeigten die Autoren, dass sich PNA-Stränge mit hydrophoben und hydrophilen Aminosäureseitenketten im wässrigen Milieu zu Mizellen zusammen lagern. Bei Zugabe einer zur im PNA-Strang enthaltenen Nukleinsäuresequenz komplementären RNA wurden die Mizellen wieder zerstört. PNAs sollen auch genutzt werden, um eine präzise Interaktion zwischen verschiedenen Ziel-Proteinen und -Nukleinsäuren zu vermitteln. - zur Originalliteratur

Simulating 500 million years of evolution with a language model (Hayes et al. 2025)

Die Autoren präsentieren mit ESM3 (Evolutionary Scale Modeling version 3) ein multimodales KI-Sprachmodell für Proteine, das Sequenz, Struktur und Funktion gemeinsam modellieren und neue Proteine gezielt generieren kann. Anders als bisherige Protein-Sprachmodelle, die meist nur Aminosäuresequenzen berücksichtigen, integriert ESM3 zusätzlich dreidimensionale Strukturinformationen sowie funktionelle Eigenschaften in einem gemeinsamen Modell. Trainiert wurde ESM3 anhand von Milliarden Proteinsequenzen sowie hunderten Millionen Proteinstrukturen und funktionellen Annotationen.

Die Autoren zeigen, dass das Modell komplexe Designaufgaben lösen kann, etwa das Einbauen funktioneller Bindungsstellen in neuartige Proteinstrukturen sowie die Generierung von Proteinen mit geringer Sequenz- und Strukturähnlichkeit zu bekannten Proteinen. Durch gezielte Eingaben (Prompts) lassen sich gewünschte Eigenschaften, Strukturmotive oder Funktionen vorgeben, woraufhin ESM3 passende Proteinsequenzen erzeugt. Als zentrales experimentelles Beispiel zeigen die Autoren die Entwicklung eines neuartigen fluoreszierenden Proteins (esmGFP). Dieses Protein weist trotz einer Sequenzidentität zu bekannten fluoreszierenden Proteinen von nur etwa 58 % weiterhin funktionelle Fluoreszenz auf. Die Autoren schätzen, dass diese Sequenzdistanz einer evolutionären Zeitspanne von über 500 Millionen Jahren im Vergleich zum nächstverwandten bekannten Protein entspricht.

Megabase-scale human genome rearrangement with programmable bridge recombinases (Perry et al. 2026)

Die Autoren entwickelten eine neue Klasse RNA-gesteuerter Rekombinasen (bridge-Rekombinasen) für die gezielte Genommanipulation in menschlichen Zellen. Im Gegensatz zu klassischen CRISPR-Systemen, die nur eine DNA-Zielsequenz über eine guide-RNA erkennen, können bridge-Rekombinasen mithilfe einer bridge-RNA (bRNA) gleichzeitig zwei unterschiedliche DNA-Sequenzen binden. Dadurch sind nicht nur Geninsertionen, sondern auch präzise Exzisionen, Inversionen und umfangreiche genomische Umlagerungen möglich.

Ausgehend von 72 natürlichen bridge-Rekombinase-Systemen bakteriellen Ursprungs identifizierten die Autoren ISCro4 aus Citrobacter rodentium als besonders effizient für Genomveränderungen in menschlichen Zellen. Zur genetischen Optimierung wurde sowohl die Rekombinase selbst als auch die zugehörige bRNA weiterentwickelt. Durch deep-mutational-scanning der Rekombinase in humanen Zellen wurden die Mutationen S30T, P54Q und S243H als aktivitätssteigernd identifiziert. Die kombinierte enhanced-ISCro4-Variante erreichte eine Insertionseffizienz von bis zu 20 % und ermöglicht genomische Umlagerungen im Megabasen-Bereich.

Als Machbarkeitsnachweis wurden mehrere therapeutisch relevante Anwendungen gezeigt, darunter die präzise Exzision des BCL11A-enhancers (relevant für die Therapie von Sichelzellanämie und β-Thalassämie) sowie die Entfernung pathologischer GAA-Repeatsequenzen im FXN-Gen, die bei Friedreich-Ataxie, einer seltenen, genetisch bedingten und fortschreitenden Nervenerkrankung ursächlich sind.

High-fidelity human chromosome transfer and elimination (Petris et al. 2025)

Die Autoren beschreiben eine neue Methode, mit der menschliche Chromosomen gezielt zwischen Zellen übertragen, genetisch verändert und anschließend wieder in menschliche Zellen eingebracht werden können. Langfristiges Ziel ist die Entwicklung synthetischer menschlicher Genome.

Als Chromosomenspender diente die nicht-transformierte, immortalisierte menschliche RPE1-Zelllinie, deren Chromosomen mithilfe eines PiggyBac-Systems mit Fluoreszenz- und Resistenzmarkern versehen wurden.  Kondensierte Chromosomen wurden aus mitotischen Zellen isoliert und per Transfektion in murine embryonale Stammzellen (mESCs) übertragen. Diese sogenannten assembly cells enthalten jeweils nur eine einzelne Kopie des jeweiligen menschlichen Chromosoms, wodurch gezielte genetische Veränderungen erleichtert werden. Auf dieser Grundlage demonstrierten die Autoren anschließend die Möglichkeit präziser genetischer Eingriffe, indem ein definierter Abschnitt auf Chromosom 20 gezielt verändert wurde. Hierfür wurde zunächst eine künstliche landing pad-Sequenz mit Fluoreszenz- und Resistenzmarkern in das Chromosom 20 integriert. Anschließend wurde die Zielregion mithilfe von CRISPR/Cas9, homologer Rekombination und eines BAC-Vektors durch etwa 10 kb synthetische DNA mit gezielten stillen Mutationen (watermarks) ersetzt.

Im nächsten Schritt wurden die modifizierten Chromosomen mithilfe einer verbesserten microcell-mediated chromosome transfer-Methode (R-MMCT) wieder in menschliche Zellen übertragen. Dadurch wurden gezielt Aneuploidien wie Trisomien und Tetrasomien erzeugt. Im Anschluss wurde das endogene Chromosom mithilfe CRISPR-vermittelter Schnitte im Zentromerbereich entfernt, sodass diploide Zellen entstanden, die ausschließlich das synthetisch veränderte Chromosom enthielten.

Durch verschiedene Methoden, wie u. a. whole-genome-sequencing und optical genome mapping, konnte gezeigt werden, dass die Chromosomen während des gesamten Prozesses weitgehend intakt blieben. Es traten nur wenige unerwünschte Mutationen, wie z. B. SNPs (single nucleotide polymorphisms) und INDELs (insertions and deletions) sowie geringe strukturelle Veränderungen auf, deren Häufigkeit mit der von Kontrollzellen vergleichbar war.

Ultra-high-throughput mapping of genetic design space (Rai et al. 2026)

Die Autoren stellen eine hochdurchsatzfähige Plattform zur Analyse komplexer genetischer Schaltkreise vor, CLASSIC (combining long- and short-range sequencing to investigate genetic complexity), deren experimentell gewonnene Daten anschließend für KI-gestützte Vorhersagen neuer Schaltkreise genutzt werden können.

In den zentralen Experimenten wurden über 100.000 barcodierte Gen-Schaltkreise konstruiert und in humanen Zellen (modifizierte HEK293T-Zellen) getestet. Diese synthetischen Schaltkreise basieren auf einem einheitlichen funktionellen Prinzip: Ein künstlicher Transkriptionsfaktor wird durch den Induktor 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) aktiviert, gelangt daraufhin in den Zellkern und reguliert die Expression eines Reporter-Gens (z. B. GFP). Durch systematisches Variieren der genetischen Bausteine wie Promotoren, Aktivierungsdomänen, DNA-Bindungsstellen, Abstände zwischen den Expressionseinheiten und regulatorischen Elementen können große Bibliotheken unterschiedlicher Schaltkreisdesigns erzeugt und anschließend stabil in die HEK293T-Zellen eingebracht werden. 

Anschließend wurden die eingebrachten Schaltkreisvarianten funktionell analysiert. Hierfür kombinierte CLASSIC zwei Sequenzierungsverfahren: Mit long read-Sequenzierung (Nanopore) wurde die vollständige DNA jedes Konstrukts gemeinsam mit seinem Barcode bestimmt, sodass eine eindeutige Zuordnung von genetischer Zusammensetzung zu Barcode möglich war. Anschließend wurden die Zellen nach Reporter-Expression (Fluoreszenzintensität) sortiert und der Barcode mittels short read-Sequenzierung (Illumina) aus den jeweiligen Expressionsklassen ausgelesen. Dadurch ließ sich rekonstruieren, welche genetischen Konstrukte mit welchem Expressionsniveau assoziiert waren.

Die so gewonnenen Datensätze wurden anschließend genutzt, um maschinelle Lernmodelle zu trainieren, die das Verhalten bislang nicht getesteter Gen-Schaltkreise vorhersagen können. Die Studie zeigt, dass solche Modelle komplexe Genexpressionsmuster zuverlässig abschätzen und funktionell optimierte Schaltkreisdesigns identifizieren können, auch in sehr großen genetischen Designräumen mit bis zu Milliarden möglicher Kombinationen.

Insgesamt präsentiert die Arbeit einen skalierbaren, datengetriebenen Ansatz für die synthetische Biologie, der den selbst-verstärkenden Lernzyklus (design–build–test–learn cycle) deutlich beschleunigt und eine systematische, vorhersagbare Entwicklung komplexer genetischer Systeme ermöglicht.

A generalized platform for artificial intelligence-powered autonomous enzyme engineering (Singh et al. 2025)

Die Autoren entwickelten eine Plattform für autonomes Enzym-Engineering, die KI-Methoden, große Sprachmodelle (LLMs) und automatisierte Labore kombiniert. Ziel der Studie ist es, Proteine mit gewünschten Eigenschaften effizienter, ohne umfangreiche menschliche Eingriffe und ohne Bedarf an Expertenwissen zu entwickeln. Dafür benötigt das System lediglich die Aminosäuresequenz eines Proteins sowie eine messbare Zielgröße (Fitnessfunktion), beispielsweise die Enzymaktivität, um zu bestimmen, ob eine Proteinvariante eine höhere oder niedrigere Fitness bzw. Aktivität im Vergleich zu anderen Varianten aufweist. 

Die Plattform verbindet KI-gestützte Bewertung und Priorisierung von Proteinvarianten mit der automatisierten Laborplattform iBioFAB (Illinois Biological Foundry for Advanced Biomanufacturing), welche mittels Robotik in der Lage ist, Mutanten selbstständig zu erzeugen, Experimente durchzuführen und auszuwerten. Dabei werden keine vollständig neuen Proteine entworfen, sondern bestehende Enzyme durch gezielte Aminosäureaustausche schrittweise optimiert. Für die erste Evolutionsrunde wird eine initiale Mutantenbibliothek mithilfe von Protein-Sprachmodellen wie ESM-2 und EVmutation entworfen. Die experimentellen Ergebnisse dienen anschließend zum Training eines überwachten machine-learning-Modells, das in weiteren Zyklen verbesserte Proteinvarianten vorhersagt.

Zur Demonstration optimierten die Autoren zwei unterschiedliche Enzyme: die Halogenid-Methyltransferase aus der Pflanze Arabidopsis thaliana (AtHMT) sowie eine Phytase aus dem Bakterium Yersinia mollaretii (YmPhytase). Innerhalb von vier Evolutionsrunden über einen Zeitraum von vier Wochen erreichte die Plattform eine 16-fache Steigerung der Ethyltransferase-Aktivität von AtHMT und eine 26-fache Erhöhung der Phytaseaktivität bei neutralem pH-Wert. Dafür mussten jeweils weniger als 500 Varianten experimentell getestet werden.

Die Arbeit verdeutlicht das Potenzial autonomer Experimentierplattformen, um Proteinengineering und biotechnologische Forschung künftig deutlich effizienter und skalierbarer zu gestalten.

Establishing a synthetic orthogonal replication system enables accelerated evolution in E. coli (Tian et al. 2024)

Die Autoren haben ein synthetisches DNA-Replikationssystem in lebenden Escherichia coli-Bakterien etabliert, das unabhängig vom natürlichen Replikationsprozess der Wirtszelle funktioniert. Es basiert auf vier Genen, die für die in vivo-Replikation des Genoms des Bakteriophagen PRD1 essenziell sind und zu einem einzigen Replikationsoperon kombiniert wurden, das durch einen IPTG-induzierbaren Promotor kontrolliert und nicht durch Polymerasen des Wirtes vervielfältig wird. Die Operon-tragenden E. coli waren in der Lage, ein lineares Replikon zu replizieren, in dem ein gfp- und ein Kanamycin-Resistenzgen unter der Kontrolle konstitutiver Promotoren exprimiert wurden, die von Bakteriophagen-ITR-Sequenzen flankiert waren. Die Effizienz der linearen Replikon-Expression wurde durch die Zugabe eines Nuklease-Inhibitors verbessert, wodurch die lineare doppelsträngige DNA vor dem Abbau geschützt wurde. Ein Replikon von 16,5 kb wurde erfolgreich repliziert. Unter Selektionsdruck war die Replikation über 300 Generationen hinweg stabil. Wenn drei orthogonale Replikons gleichzeitig repliziert wurden, hielt die Stabilität über 100 Generationen an. Durch Zugabe einer induzierbaren dCas9 zur Unterdrückung des IPTG-responsiven Promotors ermöglicht das System die Regulierung der Kopienzahl und damit der Evolutionsdynamik. Spezifische Mutationen in orthogonalen DNA-Polymerasen erhöhen die Mutationsraten des Replikons um das 100- bis 10.000-fache, ohne die Mutationsrate des Genoms zu beeinflussen. Das System bietet somit eine Plattform für eine beschleunigte kontinuierliche Mutations-Evolution, die einfach, stabil und skalierbar ist.

Oriented triplex DNA as a synthetic receptor for transmembrane signal transduction (Chen et al. 2024)

Die Autoren haben einen aus DNA bestehenden synthetischen Rezeptor hergestellt. Der Transmembranrezeptor ist über Cholesterin in einer Lipid-Doppelschicht verankert und durchzieht diese zweimal. Ein dritter DNA-Strang zeigt nach außen wobei eine komplementäre Hilfssequenz für die Ausrichtung nach außen sorgt. Durch eine Absenkung des pH-Wertes wird die räumliche Anordnung des Rezeptors geändert, sodass der dritte Strang von der äußeren auf die innere Membranschicht übergeht. Dadurch durchzieht der Rezeptor die Membran nun dreimal und die Signalübertragung über die Membran hinweg startet. Diese Arbeit präsentiert ein vielseitiges Design für synthetische Rezeptoren, das sich durch Modularität, Programmierbarkeit und Steuerbarkeit auszeichnet.

Sequence modeling and design from molecular to genome scale with Evo (Nguyen et al. 2024) 

Die Autoren trainierten ein künstliches Intelligenzmodell (KI-Modell) namens Evo anhand von Millionen von Bakterien- und Phagengenomen, um Vorhersagen über DNA-, RNA- und Proteinfunktionen sowie die Erzeugung komplexer Systeme auf Basis von CRISPR-Cas und transponierbaren Elementen zu ermöglichen. Evo generiert DNA-Sequenzen mit plausibler Genomorganisation und einer Länge von mehr als einer Megabase. Die Ergebnisse wurden experimentell validiert und lieferten die ersten Beispiele für ein Protein-RNA- und Protein-DNA-Co-Design mittels KI. Evo lernt, wie kleine Veränderungen in der DNA-Sequenz die Fitness des gesamten Organismus beeinflussen. In Verbindung mit neuen Techniken für groß angelegte Genomveränderungen erweitert Evo Anwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie und im biologischen Design auf Ebene ganzer Genome. 

Cell-type-directed design of synthetic enhancers (Taskiran et al. 2024)

Die Autoren entwickelten Enhancer (kurze DNA-Sequenzen, die eine zelltypspezifische Genexpression ermöglichen) mit Hilfe bereits validierter deep-learning-Modelle. Dabei wurden drei Strategien zum Sequenzdesign verwendet. Die erste Strategie war eine Nukleotid-für-Nukleotid in silico-Evolution der Sequenz. Diese ging von 500 bp langen Zufallssequenzen aus, wobei iterativ Mutationen eingeführt wurden, um bestimmte Gehirnzellen der Fruchtfliege oder menschliche Krebszellen anzusteuern. Die scores der Mutationen wurde dazu mit einem deep-learning-Modell vorhergesagt. Die Enhancer wurden anschließend in transgenen Zelllinien getestet. Zusätzlich wurde geprüft, ob ein Enhancer, der in einem Zelltyp aktiv ist, so verändert werden kann, dass er auch in einem zweiten Zelltyp aktiv wird, und ob ein Enhancer, der in mehreren Zelltypen aktiv ist, so verändert werden kann, dass er in einem einzigen Zelltyp aktiv wird. In einer zweiten Strategie wurde eine Kombination bekannter Aktivator-Sequenzmotive verwendet, um einen zelltypspezifischen Enhancer zu entwerfen. In der dritten Strategie wurden sogenannte generative adversarial networks verwendet, um funktionelle und spezifische Enhancer zu generieren. Zusammenfassend zeigt diese proof-of-concept-Studie, dass Enhancer-Designstrategien an verschiedene biologische Systeme und sogar andere Spezies, einschließlich des Menschen, angepasst werden können.

A split ribozyme that links detection of a native RNA to orthogonal protein outputs (Gambill et al. 2023) Die Autoren entwickelten eine Strategie zur intrazellulären Erkennung spezifischer RNA-Moleküle durch den Einsatz von Ribozymen. Bei dieser Plug-and-Play-Strategie, die als Ribozyme-ENabled Detection of RNA (RENDR) bezeichnet wird, aktiviert eine zelluläre RNA (Ziel-RNA) eine Spleißreaktion, die wiederum eine mRNA erzeugt, die für ein beliebiges Reporterprotein (z. B. grün fluoreszierendes Protein, GFP) kodiert. Die Strategie basiert auf einem Ribozym, das synthetisch in zwei nicht-funktionale Fragmente gespalten wurde, an die jeweils RNA-guide-Sequenzen gebunden sind, die mit der RNA-Inputsequenz interagieren sollen. In Gegenwart der RNA-Inputsequenz werden die beiden transkribierten Ribozymfragmente zusammengeführt und bilden einen funktionalen Ribozymkomplex, der die Reporter-mRNA spaltet und so zur Expression des funktionalen Reporterproteins führt. Ein entscheidender Schritt bei der Entwicklung der RENDR-Plattform war die Identifizierung funktioneller Spaltstellen in der Struktur des Spleiß-Ribozyms von Tetrahymena thermophila. Zu diesem Zweck wurde ein Hochdurchsatz-Labor-Evolutionsansatz verwendet, bei dem in vitro Transposon-Mutagenese mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gekoppelt wurde. Es wurden verschiedene Spaltstellen identifiziert, die eine hohe Empfindlichkeit und Dynamik bei der RNA-Erkennung ermöglichen. Darüber hinaus entwickelten die Autoren weitere RENDR-Varianten, die einen einfachen Austausch verschiedener Gene ermöglichen, die für Protein-Outputs (kolorimetrische, gasförmige und regulatorische Outputs) kodieren und die Übertragbarkeit auf verschiedene Gram-negative Bakterien (Escherichia coli, Shewanella oneidensis und Vibrio natriegens) demonstrieren. Schließlich wurde die Produktion von pigmentproduzierenden Enzymen in Gegenwart von Antibiotikaresistenzgenen in E. coli als Anwendungsnachweis demonstriert, wodurch ein kostengünstiger und einfacher Ansatz für den Nachweis antibiotikaresistenter Mikroben bereitgestellt wird.

A polycistronic system for multiplexed and precalibrated expression of multigene pathways in fungi (Yue et al. 2023) Die Autoren entwickelten eine Strategie für die Zusammenstellung von Multigen-Signalwegen mit dem erforderlichen Expressionsniveau jedes Gens, die als HACKing (Highly efficient and Accessible system by CracKing genes Into the Genome) bezeichnet wird. Die Strategie basiert auf der Integration einer 9-bp-Nukleotidsequenz (short intergenic sequence 6 (IGG6)), die eine effiziente polycistronische Genexpression in Hefen und Fadenpilzen in Verbindung mit einer multiplexen CRISPR/Cas9-basierten Genomeditierung ermöglicht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass IGG6 die Re-Initiierung der Translation vermittelt, wodurch separate Gene zu einem funktionellen Operon verbunden werden können. Mit HACKing kann das Expressionsniveau einzelner Enzyme vorkalibriert werden, indem deren Translation mit der von Wirtsproteinen verknüpft wird, deren Menge unter den gewünschten Fermentationsbedingungen vorab bestimmt wurde. Die HACKing-Strategie wurde durch die Konstruktion von Biosynthesewegen endogener oder heterologer Terpenoidprodukte in Saccharomyces cerevisiae validiert. Aufgrund seiner Vorhersagbarkeit, Einfachheit, Skalierbarkeit und Geschwindigkeit kann HACKing bei der Entwicklung von Pilzstoffwechselwegen für wertvolle Metabolite eingesetzt werden.

CRAPS: Chromosomal-Repair-assisted Pathway shuffling in yeast (Dykstra et al. 2023) Eine grundlegende Herausforderung des Metabolic Engineering besteht darin, riesige Kombinationen orthologer Enzyme über einen mehrstufigen biochemischen Stoffwechselweg zusammenzustellen und zu untersuchen. Bei den derzeitigen Arbeitsabläufen zur Zusammenstellung von Stoffwechselwegen werden genetische Abschnitte ex vivo kombiniert und eine Stoffwechselwegkonfiguration pro Röhrchen oder Well zusammengestellt. Hier stellen die Autoren CRAPS (Chromosomal-Repair-Assisted Pathway Shuffling) vor, eine in vivo-Technik zur Stoffwechselweggestaltung, die die Selbstorganisation einer Stoffwechselwegkonfiguration pro Zelle in einer einstufigen Transformation ermöglicht. CRAPS nutzt den Hefe-Chromosomenreparaturweg (CR) und verwendet einen Pool inaktiver, chromosomal integrierter orthologer Genvarianten, die einem mehrstufigen Zielweg entsprechen. Der CRAPS-Weg besteht aus genfreien Expressionskassetten, die jeweils eine einzigartige synthetische Cas9-Zielstelle besitzen. Die Genvarianten weisen eine partielle Homologie zu den flankierenden Promotor- und Terminatorelementen auf und sind vor der CR-Reparatur inaktiv. Durch die Zufuhr von gRNAs zum CRAPS-Wirt wird an jedem Expressionsort ein Doppelstrangbruch eingeführt, der den CR-Signalweg aktiviert und ein Genortholog unter die Transkriptionskontrolle seines designierten Promotors stellt. So wird eine Genvariante pro Signalwegschritt exprimiert, was zu einer einzigartigen Signalwegkonfiguration in jeder Zelle und damit Kolonie führt. Die Autoren setzten CRAPS ein, um mehr als 1000 theoretische Kombinationen eines vierstufigen Carotinoid-Biosynthesenetzwerks zu erstellen. Durch die Untersuchung des CRAPS-Signalwegraums wurden Stämme mit unterschiedlichen Farbphänotypen und Carotinoid-Produktprofilen gewonnen.

A multiplexed bacterial two-hybrid for rapid characterization of protein–protein interactions and iterative protein design (Boldridge et al. 2023) Die Autoren haben eine Methode zur Identifizierung und Gestaltung orthogonaler Coiled-Coil-Proteine entwickelt. Diese Strategie umfasst die Entwicklung einer bakteriellen Zwei-Hybrid-Methode der nächsten Generation (NGB2H), einer erheblich modifizierten Version des Adenylatcyclase-Zwei-Hybrid-Systems von Bordetella pertussis, die eine Multiplex-Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) ermöglicht. Das System verwendet einen Barcode-Ansatz und ermöglicht eine umfassende Analyse, ohne dass alle möglichen Paarungen manuell getestet werden müssen. Letztendlich wurden große Mengen orthogonaler synthetischer Coiled Coils entworfen, erstellt und getestet. Der große Datensatz wurde verwendet, um einen genaueren Coiled-Coil-Bewertungsalgorithmus (iCipa) zu trainieren. Dies erfolgte in mehreren Schritten, wobei die Größe der synthetisch entworfenen Bibliotheken von 256 Interaktionen auf mehr als 18.000 Interaktionen erhöht wurde. Auf dieser Grundlage haben die Autoren den ihrer Meinung nach bisher größten Satz orthogonaler Coiled Coils mit fünfzehn zielgerichteten Interaktionen ermittelt. Der Ansatz bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für den Entwurf orthogonaler PPIs.

Illuminating protein space with a programmable generative model (Ingraham et al. 2023) Die Autoren stellen Chroma vor, ein generatives Modell für Proteine und Proteinkomplexe, das in der Lage ist, direkt neue Proteinstrukturen und -sequenzen zu generieren. Chroma ist programmierbar und kann Proteine mit einer Vielzahl von benutzerdefinierten Eigenschaften erzeugen, wie z. B. den Abstand und Kontakt zwischen Aminosäureresten, spezifischen Proteinregionen und -strukturen sowie andere Merkmale, die durch Klassifikatoren definiert werden. Chroma kann Proteine mit beliebigen und komplexen Formen erzeugen und hat die Fähigkeit, Beschreibungen der gewünschten Eigenschaften als freien Text zu akzeptieren. Es ist in der Lage, extrem große Proteine und Proteinkomplexe (mit mehr als 3.000 Aminosäureresten) auf einem handelsüblichen Grafikprozessor in wenigen Minuten zu generieren. Die Autoren wählten einige der von Chroma erzeugten Proteine aus und testeten sie experimentell. Die experimentelle Validierung von 310 Proteinen zeigte, dass Chroma eine ausreichend genaue Verteilung gelernt hat, sodass die entworfenen Proteine exprimiert werden, sich korrekt falten, günstige biophysikalische Eigenschaften aufweisen und oft mit den beabsichtigten Strukturen übereinstimmen. Darüber hinaus wurden die Kristallstrukturen von zwei entworfenen Proteinen bestimmt, die eine Übereinstimmung auf atomarer Ebene mit den Chroma-Proben zeigten.

Für diesen Bereich wurden sieben Publikationen ausgewählt.
Schwärmende Bakterienkolonien, die durch die Expression von Adhäsinen und ihren komplementären Antigenen miteinander interagieren und verschiedene Muster ausbilden können, wurden entwickelt. Diese können beispielsweise in diagnostischen Displays eingesetzt werden (Kim et al. 2022). Design und Konstruktion von verschiedenen metabolischen Schaltkreisen oder Bakterienstämmen können durch automatisierte Plattformen wie Galaxy-SynBioCAD erleichtert werden. Das Gemeinschaftsprojekt erlaubt es allen Interessierten, neue Werkzeuge hinzuzufügen und alte zu bewerten (Herisson et al. 2022). Auch die open-source-Plattform basicsynbio soll das Konzipieren genetischer Schaltkreise erleichtern. Es basiert auf einer standardisierten DNA-Assemblierungsmethode und ermöglicht es Nutzern, verschiedenste Schaltkreise zu entwickeln und zu exportieren (Haines et al. 2022). Um biosynthetische Gencluster für die Anwendung nutzbar zu machen, können diese in silico umgestaltet und zu neuen synthetischen genetischen Elementen zusammengefügt werden. Dadurch wird auch eine Expression in einem anderen Reich der Lebewesen möglich (Patel et al. 2022). Die Evolink-Plattform erlaubt es, zuvor konzipierte Ribosomen, deren rRNAs verbunden sind und die in der Lage sind, nicht-natürliche Aminosäuren in Proteine einzubauen, in ihrer Funktion zu verbessern. Die Plattform erstellt und testet verschiedene Nukleinsäurebibliotheken mithilfe iterativer design-build-test-Analysen (Kim et al. 2022). Das METIS (Machine-learning guided Experimental Trials for Improvement of Systems)-System wurde entwickelt, um die Lücke zwischen maschinellem Lernen und seiner Anwendung in biologischen System zu schließen. Experimentatoren brauchen keine Programmiererfahrung, um biologische Netzwerke wie den synthetischen CETCH-Zyklus zur CO2-Fixierung zu optimieren (Pandi et al. 2022). Ein maschineller Algorithmus wurde ebenso verwendet, um die Effektivität einer PET-Hydrolase zu steigern. Diese soll zum enzymatischen Abbau von Plastikabfall genutzt werden (Lu et al. 2022).

Division and regrowth of phase-separated giant unilamellar vesicles (Dreher et al. 2021) Die Autoren haben einen vollständig kontrollierten Teilungsmechanismus für große unilamellare Vesikel (GUV) entwickelt. Dazu verwendeten sie die Phasentrennung, um GUVs mit einer ungeordneten und einer geordneten Lipidphase zu konstruieren. Wenn die Osmolarität des umgebenden Mediums erhöht wurde, verringerte sich das Volumen der GUVs durch Wasserabfluss und es bildeten sich zwei kleinere Vesikel. Die Technik wurde auch verwendet, um eine lichtinduzierte Vesikelteilung zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde dem GUV-haltigen Medium in Bis-(5-carboxymethoxy-2-nitrobenzyl)-Ether (CMNB) eingeschlossenes Fluorescein zugesetzt. Bei Beleuchtung wird diese zunächst nicht fluoreszierende Verbindung in drei Komponenten aufgespalten, so dass die Osmolarität erhöht wird und sich die GUVs teilen. Die Autoren untersuchten auch das Vesikelwachstum durch Fusion von Vesikeln mit geordneten und ungeordneten Lipiden und zeigten, dass Fusionen nur mit einer eher geringen Frequenz stattfinden. Die Fusionshäufigkeit kann durch die Verwendung von CaCl2 oder DNA-basierten zipper-ähnliche Molekülen, die das SNARE-Protein nachahmen, erhöht werden. Diese bringen die Vesikel in räumliche Nähe zueinander und treiben die Fusion voran. Zusammengenommen ermöglicht diese Methode eine kontrollierbare GUV-Teilung in zwei Kompartimente der zweiten Generation und stellt einen weiteren Schritt in Richtung synthetische Zellteilung dar.

Manufacture of multi-layered artificial cell membranes through sequential bilayer deposition on emulsion templates (Ip et al. 2021) Die Autoren entwickelten eine emulsionsbasierte Methode zur Erzeugung von großen Vesikeln mit mehreren Membranen. Zur Erzeugung dieser mehrschichtigen Vesikel wurden Wasser-in-Öl-Tröpfchen als Vorlage verwendet und nacheinander mit Lipid-Monolayern umgeben. Das innerste Monolayer-Tröpfchen wurde durch Inkubation von wässrigen Emulsionströpfchen in einer Öllösung gebildet. Weitere Monoschichten wurden hinzugefügt, indem das ursprüngliche Tröpfchen in einer Zentrifuge durch mehrere Monoschicht-stabilisierte Öl/Wasser-Grenzflächen mit abwechselnd hydrophober/hydrophiler Außenorientierung getrieben wurde. Die erzeugten Vesikel mit mehreren Schichten hatten einen Radius von 0,5 bis 50 µm und waren mechanisch stabil. Die erfolgreiche Schichtung wurde durch Zugabe verschiedener fluoreszierender Lipide (Rh-PE, NBD-PE, Cy-5-PE) zu jeder Doppelschicht kontrolliert. Zusätzlich wurde dem Vesikelmedium Natriumdithionit, ein membranundurchlässiger NBD-Quencher, zugesetzt. Aufgrund des fehlenden Quenchens konnten die Autoren zeigen, dass die inneren Membranen, die NBD-PE enthalten, durch die zusätzlich aufgetragenen äußeren Membranen geschützt sind, wodurch eine erfolgreiche und stabile Schichtung nachgewiesen werden konnte. Die Membranmechanik, wie z. B. die Biegesteifigkeit, wurde durch thermische Fluktuation der Vesikel getestet, die mittels Phasenkontrastmikroskopie nachgewiesen wurde. Das Ergebnis war, dass mit zunehmender Anzahl von Schichten die Biegesteifigkeit zunahm, was bestätigt, dass die Mehrfachschichten mechanisch gekoppelt sind. Diese Methode könnte eine potenzielle Lösung für die Einbindung einer breiten Palette von Funktionsmodulen in synthetische Vesikel darstellen.

Li et al. (2020) etablierten eine skalierbare magnetische Anordnung zur Erstellung von Kolonien aus Zell-imitierenden großen unilamellaren Vesikeln (GUVs). Um eine auf Magnetfeldern basierende Koloniebildung von GUVs zu entwickeln, wurde ein Edelstahl-Netz mit einem Mikrotiterplattenmuster, welches sich in einem paramagnetischen Medium befand, mit GUVs beladen und zwischen zwei Magnete mit Nord-Süd-Ausrichtung gelegt. Die GUVs wurden magnetisch zu Kolonien zusammengefügt, die auch eine höhere Stabilität gegenüber einem osmotischen Ungleichgewicht aufwiesen als einzelne GUVs. Um die strukturelle Komplexität von biologischem Gewebe mit unterschiedlichen Zelltypen nachzuahmen, wurden zwei Arten von GUVs mit unterschiedlichen Zusammensetzungen erzeugt und magnetisch manipuliert. In Abhängigkeit von der Richtung des Magnetfeldes, konnten die verschiedenen GUV-Arten voneinander getrennt und dabei entweder in unterschiedlichen Richtungen oder in unterschiedlichen Schichten sortiert werden oder sie bildeten eine serielle Verteilung innerhalb der Mikrowells. In einem proof-of-principle-Experiment wurden zwei unterschiedliche GUV-Arten generiert und magnetisch voneinander getrennt. Die GUVs in der Kolonie 1 enthielten Poren und wurden in Gegenwart von Glukose-Oxidase gebildet, während die GUVs der Kolonie 2 zusammen mit der Meerrettichperoxidase gebildet wurden. Zum Medium hinzugegebene Glukose gelangte über die Poren in die GUVs der Kolonie 1, H2O2 wurde produziert und diffundierte in die GUV der Kolonie 2, in denen die Meerrettichperoxidase die Produktion eines roten Fluorophors katalysierte. Da das rote Fluorophor ausschließlich in GUVs der Kolonie 2 nachgewiesen werden konnte, wurde gezeigt, dass das System in der Lage ist, die Kompartimentierung und die räumliche Trennung biochemischer Reaktionen natürlichen Gewebes rudimentär nachzuahmen. Diese Arbeit könnte die Erstellung und Untersuchung Gewebe-ähnlicher Strukturen ermöglichen und stellt einen wichtigen Schritt hinsichtlich synthetischer Gewebe dar. - zur Originalliteratur

Hamashima et al. (2019) erweiterten, aufbauend auf den Arbeiten von Kimoto et al. (2013), eine Sequenziermethode zur präzisen Lokalisation der unnatürlichen Base D_s: (7-(2-Thienyl)-imidazo-[4,5-b]pyridin) in Aptamer-Kandidaten aus ExSELEX-Bibliotheken (genetic alphabet expansion for systematic evolution of ligands by exponential enrichment). Hierfür wurden zwei unterschiedliche replacement-PCRs verwendet, um unnatürliche Basen gegen natürliche Basen (N) auszutauschen, mit dem Ziel, die so generierten Produkte mittels deep sequencing zu untersuchen. Um Rückschlüsse auf die tatsächliche Position von Ds ziehen zu können, wurde eine Enzyklopädie erstellt, welche die Häufigkeit und Zusammensetzung der Konversion bei einem bestimmten Sequenzkontext (NNNDsNNN) beinhaltet. Durch Abgleich der aktuellen Daten mit den Enzyklopädiedaten konnte somit auf die Position von Ds rückgeschlossen werden. - zur Originalliteratur

Koch et al. (2019) fusionierten DNA-Moleküle mit funktionellen Materialien, um einen stabilen Datenspeicher ohne Informationsverlust zu generieren (DNA-of-things storage architecture). Hierfür wurden die DNA-Moleküle in eine Kapsel aus Silica-Nanopartikeln eingebettet, um einen Abbau der DNA im Herstellungsprozess des Speichers zu verhindern. In einem proof of priciple-Experiment wurde die in Silica enkapsidierte DNA (SPED) in Polycaprolacton (PCL), einem biologisch abbaubaren Thermoplastik-Polyester, eingebettet und mittels 3D-Druck in die Form eines Hasen gedruckt. Anschließend wurde an einer randomisierten Stelle des Hasen ein Teil entnommen und die darin befindliche DNA extrahiert, amplifiziert und dekodiert. Die im Teil des Hasen gespeicherte Datei konnte exakt wiederhergestellt werden und diente als Vorlage zum Druck der F1-Generation. Auch in den nachfolgenden Generationen bis F5 wurden keine Datenverluste beobachtet. Nachfolgende Experimente, bei denen die SPED Videodaten enthielten und in verschiedenste Materialen eingebettet wurden, bestätigten die Stabilität der SPED. Somit ist ein System entstanden, welches z. B. für die Aufbewahrung sensibler Daten über Menschengenerationen hinweg genutzt werden könnte. - zur Originalliteratur

Lee et al. (2019) - Die Autoren erweiterten das Wissen zu Flexizymen, die genutzt werden, um neuartige chemische Monomere an tRNAs zu binden. Die tRNAs bringen die Monomere zu den Ribosomen, sodass diese als nicht natürliche Aminosäuren in Peptide eingebaut werden können. Lee et al. erstellten erstmals definierte Design-Regeln für die neuartigen Monomere, damit diese ohne aufwändigen trial-and-error-Prozess einfach an tRNAs gebunden werden können. So kann eine Vielfalt an Monomeren durch Ribosomen zu Peptid-Hybridprodukten zusammengefügt werden. Als Anwendung dieser Umprogrammierung des genetischen Codes ist die Synthese neuartiger (biologischer) Materialien, z. B. high-performance Materialen, oder neuartiger Medikamente anvisiert. - zur Originalliteratur

Zhang et al. (2019) entwickelten eine Methode zur Sicherung der Daten in DNA-Datenspeichern, welche sich vom „Auslesen“ der DNA mittels Sequenzierung abkoppelt. Die in dieser Arbeit verwendete Origami-Kryptographie basiert auf dem self assembly von Biomolekülen. Für die Verschlüsselung des DNA-Datenspeichers durch den Versender wird ein langer scaffold-DNA-Strang mit message-Strängen beladen, welche ein Biomolekül wie z. B. Biotin enthalten und sich je nach zu kodierender Information in der Anzahl und Position am scaffold unterscheiden. Die Entschlüsselung der Nachricht beim Empfänger erfolgt mittels hunderter, nachrichtspezifischer scaffold-Stränge, welche den scaffold in eine bestimmte DNA-basierte Nanostuktur falten. Diese Nanostruktur ähnelt einem QR-Code mit quadratischer Form, aber mit einem Brailleschrift-ähnlichen Muster, bestehend aus mehreren Punkten. Die Orientierung des Quadrates, welche zum Auslesen der Daten wichtig ist, wird durch einen marker-DNA-Strang gewährleistet. Dieser wird vom Versender während der Verschlüsselung zu den message-Strängen hinzugegeben und befindet sich an einer dezidierten Position am scaffold. Das Auslesen der Daten erfolgt anschließend mikroskopisch unter Zugabe von Streptavidin, wobei ein Braille-Punkt einer binären Zahl entspricht und bei Textnachrichten entweder einen Buchstaben oder dessen Position repräsentiert. Somit ist erstmals ein auf Biomolekülen basierter und kryptographisch flexibler QR-Code-ähnlicher DNA-Datenspeicher entstanden. - zur Originalliteratur

Zhang et al. (2019) - Im Bereich der synthetischen Biologie ist in den letzten Jahren eine erhebliche Menge genetischer Daten entstanden, welche wiederum zur Konstruktion von genetischen Schaltkreisen eingesetzt werden können. Diese Daten sind über unterschiedliche Plattformen für die Anwender zugänglich. Sequenzbasierte Daten, bestehend aus bekannten und natürlichen Sequenzen, können über Datenbanken mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) abgefragt werden. Komplexere synthetische Schaltkreise und genetische Designs werden in Repositorien wie SynBioHub vorgehalten und öffentlich geteilt. Hierfür verwendet SynBioHub große Datensätzen verschiedener Plattformen, wie z. B. International Genetically Engineered Machine (iGEM). Zum standardisierten Datenaustausch sind die Daten in der Synthetic Biology Open Language (SBOL) kodiert. Da sich die Datensätze der verschiedenen Plattformen, welche SynBioHub speisen, qualitativ unterscheiden und zum Teil unstrukturiert in SBOL übersetzt werden, sind Suchanfragen und genetische Designs oft unpräzise. Aus diesem Grund implementierten Zhang et al. Organisationstechniken zur Sortierung von Informationen aus dem world wide web in SynBioHub. Ziel der Arbeit war es, die Suchergebnisse bei Suchanfragen zu brauchbaren Schaltkreisen und deren Einzelkomponenten zu präzisieren. Hierfür wurden Methoden miteinander kombiniert, welche die Rangfolge der Popularität von Schaltkreiselementen festlegen (PageRank) und die Gewichtung auftretender Duplikate verringern (clustering with data infrastructure). Das in dieser Arbeit entwickelte Programm SBOLExplorer ist als backend service in SynBioHub implementiert. Der Anwender kann daher wie gewohnt den Schaltkreis graphisch über die Applikation SBOL-Designer in SynBioHub zusammenstellen und erhält bei einer Suchanfrage automatisch die sortierten Informationen. - zur Originalliteratur

Bourgeois et al. (2018) haben ein CRISPR-Cas9-Integrationssystem entwickelt, das eine Reihe synthetischer DNA landing pads nutzt, um mehrere Kopien einer DNA in das Genom von S. cerevisiae zu integrieren. Die pads bestehen aus spezifischen gRNA-Sequenzen mit flankierenden rekombinogenen Regionen und fungieren als Zone für den Multi-Kopien-Gentransfer. Dabei können unterschiedliche pads einmal, zweimal, dreimal oder viermal im Hefegenom vorliegen. Dadurch ist es möglich, in nur einer Reaktion bis zu vier Kopien eines Gens präzise in das Genom der Hefe zu integrieren. In einem proof of principle-Experiment wurde ein Enzym (Norcoclaurin-Synthase) mit geringer katalytischer Aktivität gewählt, welches zur Synthese von Benzylisoquinolinalkaloiden genutzt wird. Durch Integration von vier Kopien des Enzymgens in die landing pads konnte die Produktion des Intermediatmoleküls ((S)-Norcoclaurin) zur Synthese des Alkaloids verdoppelt werden. - zur Originalliteratur

Atomically accurate de novo design of antibodies with RFdiffusion (Bennett et al. 2026) und De novo designed proteins neutralize lethal snake venom toxins (Vázquez Torres et al. 2025)

Die Autoren beider Publikationen nutzen speziell angepasste Versionen von RoseTTAFold Diffusion (RFdiffusion, Watson et al. 2023), einem generativen KI-Modell für das Proteindesign, um neuartige therapeutische Bindungsproteine gegen medizinisch relevante Zielstrukturen zu entwerfen. 

In der ersten Studie wurde RFdiffusion genutzt, um de novo Antikörperfragmente wie VHHs (variablen Domänen von heavy chain only-Antikörpern) und scFvs (single chain variable fragments) gegen vom Nutzer definierte Epitope zu entwerfen. Die Methode wurde auf verschiedene virale, bakterielle und tumorassoziierte Zielstrukturen angewendet, darunter solche von SARS-CoV-2, Influenza A, RSV, Clostridioides difficile-Toxin B und ein Peptid-MHC-Komplex. Nach experimenteller Validierung der im Labor exprimierten und getesteten Antikörper sowie Optimierung der Bindungsaffinitäten wurden mehrere hochspezifische Antikörper mit Bindungsstärken im niedrigen Nanomolarbereich erhalten. Kryo-elektronenmikroskopische-Analysen bestätigten eine hohe Übereinstimmung zwischen den berechneten und experimentell bestimmten Strukturen.

In der zweiten Studie wurde der Ansatz auf das Design vollständig neuartiger, de novo designter proteinbasierter Antitoxine gegen Schlangengifttoxine erweitert. Ziel waren Neurotoxine und Zytotoxine der three-finger-Toxin-Familie (3FTx), Proteintoxine, die für schwere Vergiftungen verantwortlich sind. Die entworfenen Antitoxine zeigten hohe Stabilität, nanomolare Bindungsaffinitäten und eine nahezu atomgenaue Übereinstimmung mit den Designmodellen. In Zellkultur neutralisierten sie die toxische Wirkung der Zieltoxine. In Mausmodellen zeigten insbesondere die Neurotoxin-Binder einen wirksamen Schutz vor einer tödlichen Vergiftung.

Beide Arbeiten zeigen, dass generative KI-Methoden die gezielte Entwicklung von Antikörpern und neuartigen Proteintherapeutika ermöglichen. Dadurch könnten die Entwicklungszeiten und Kosten gegenüber klassischen Verfahren wie Tierimmunisierung oder umfangreichen Screeningansätzen reduziert werden.

Atom-level machine learning of protein-glycan interactions and cross-chiral recognition in glycobiology (Carpenter et al. 2025)

Die Autoren entwickeln mit MCNet ein auf maschinellem Lernen (ML) basierendes Modell zur Vorhersage von Protein-Glykan-Interaktionen, das Glykanstrukturen auf atomarer Ebene, einschließlich ihrer vollständigen Stereochemie, repräsentiert. Im Gegensatz zu klassischen Ansätzen, bei denen Glykane über Monosaccharid-Bausteine beschrieben werden, nutzt das Modell eine vollständige atomare Darstellung der Molekülstruktur. Dadurch kann es nicht nur bekannte Glykan-Protein-Bindungen korrekt vorhersagen, sondern auch Vorhersagen für bisher nicht beobachtete Strukturen wie seltene oder künstliche Enantiomere (mirror-image) Glykane ermöglichen.

Das Modell integriert unterschiedliche bereits existierende experimentelle Datensätze, indem die Ergebnisse verschiedener Messmethoden auf eine einheitliche Skala überführt und dadurch vergleichbar gemacht werden.

Experimentelle Validierungen mit Glykan- und Lektin-Arrays bestätigen zahlreiche Vorhersagen, darunter auch unerwartete Bindungen von L-Glucose an klassische Glykan-bindende Proteine wie z. B. Fucose-bindende Lektine. Insgesamt zeigt die Studie, dass atomare ML-Modelle neue Einsichten in die Rolle von Chiralität und molekularer Erkennung in der Glykobiologie liefern und die Vorhersagefähigkeit gegenüber bisherigen Methoden erweitern.

Fabrication of cytotoxic mirror image nanopores (Firzan et al. 2025)

Die Autoren entwickelten erstmals vollständig funktionelle spiegelbildliche Nanoporen aus D-Aminosäuren (DpPorA), die auf einem natürlichen bakteriellen Porin (PorACj) aus Corynebacterium jeikeium als Ausgangsstruktur basieren. Die Spiegel-Nanoporen bilden stabile Membrankanäle und sind strukturell sowie funktionell echte Spiegelbilder ihrer L-Analoga. Durch den Austausch eines Aspartat- (D) und eines Glutamat-Rests (E) gegen Alanin entstand die Variante DpPorA DE mit höherer Leitfähigkeit und Anionenselektivität. Die Poren ermöglichen die Einzelmolekül-Detektion verschiedener Biomoleküle, darunter Peptide und α-Synuclein. Experimente mit künstlichen Membranen und die Simulation von Molekulardynamiken bestätigten ihre Stabilität und Transportfunktion. In künstlichen Vesikeln bildeten die Peptide zudem große, flexible Poren, die den Transport von Molekülen bis etwa 3 kDa ermöglichten. 

Neben den Untersuchungen in künstlichen Vesikeln wurden auch Zellkulturexperimente durchgeführt. Dabei zeigte DpPorA DE nach Zugabe zu Brustkrebszellen eine selektive zytotoxische Wirkung, während bei normalen Brustepithelzellen kein signifikanter Effekt beobachtet wurde. Dies wird darauf zurückgeführt, dass die stärker negativ geladene Membran von Brustkrebszellen die Bindung der kationischen DpPorA-DE-Peptide begünstigt. Nach der Bindung können die Peptide in die Zellmembran inserieren und dort porenartige Strukturen ausbilden, was zur Membrandestabilisierung und verminderter   Lebensfähigkeit der Zellen führt. 

Die Studie zeigt das Potenzial spiegelbildlicher Nanoporen für Biosensorik und neuartige Krebstherapien.

Synthetic organizer cells guide development via spatial and biochemical instructions (Yamada et al. 2025)

Die Differenzierung pluripotenter Stammzellen in vitro weist häufig weder die Morphogenese, also die Ausbildung dreidimensionaler Strukturen, noch die Musterbildung, die räumliche Organisation verschiedener Zelltypen, auf, wie sie während der Embryonalentwicklung durch ein natürliches Leitsystem aus Signalstoffen (Morphogengradienten) gesteuert werden. Eine naturnahe Entwicklung kann jedoch durch extraembryonale Zellen unterstützt werden, die sich selbstorganisiert um Vorläuferzellen anordnen. Die Autoren programmierten eine solche synthetische Organisator-Zelllinie aus Fibroblasten, so dass sich deren Zellen räumlich definiert um Maus-embryonale Stammzellen (mESCs) anordnen.

Hierzu erzeugten sie eine GFP-exprimierende mESC-Linie, deren Oberflächen-GFP anschließend durch eine Reihe neu entwickelter synthetischer Zelladhäsionsmoleküle (synCAMs) erkannt werden kann. synCAMs bestehen aus der intrazellulären Domäne eines nativen Adhäsionsmoleküls und einer synthetischen extrazellulären Domäne, in diesem Fall ein anti-GFP-Nanobody. Je nachdem, welche intrazelluläre Domäne für den synCAM verwendet wurde, bilden die Organisatorzellen entweder Knoten oder schalenartige Strukturen auf bzw. um die mESCs herum. Anschließend wurden die Organisatorzellen so konstruiert, dass sie das Morphogen WNT3A (wingless-related integration site 3A) sowie dessen Antagonisten DKK1 (Dickkopf-1) unter Kontrolle eines mit kleinen Molekülen induzierbaren Promotors exprimieren. Durch einen Suizidschalter, der nach Zugabe eines Wirkstoffs die Apoptose der Zellen induziert, kann die Sekretion der Morphogene unterbunden werden. WNT3A spielt eine wichtige Rolle bei der Symmetriebrechung während der Embryonalentwicklung von Säugetieren, und es konnte gezeigt werden, dass die Bereitstellung dieses Morphogens aus einem asymmetrischen Zellknoten eine Symmetriebrechung induziert und zur Streckung von Embryoid-Strukturen führt. 

Construction of a Mirror-Image RNA Nanostructure for Enhanced Biostability and Drug Delivery Efficiency (Zhang et al. 2025)

Die Autoren entwickelten eine neuartige Nanostruktur auf Basis spiegelbildlicher RNA (L-RNA), die für eine stabile und zielgerichtete Verabreichung von Therapeutika konzipiert ist. Zentrales Element ist die L-RNA-Dreiwege-Verbindungsstruktur (three-way junction, L-3WJ), die aus drei L-RNA-Oligonukleotiden besteht, welche sich durch komplementäre Basenpaarung selbstständig zu einer stabilen, dreigliedrigen Struktur zusammenlagern. Aufgrund ihrer L-Konfiguration ist diese Plattform gegenüber enzymatischem Abbau weitgehend resistent und damit deutlich stabiler als natürliche D-RNA.

An dieses Grundgerüst werden verschiedene funktionelle Komponenten modular gekoppelt. Eine siRNA gegen das anti-apoptotische Gen MCL1 wird über spezifische Basenpaar-Hybridisierung an definierte Sequenzen der L-3WJ-Struktur eingebunden und ermöglicht so gezieltes gene-silencing nach Aufnahme in die Zielzellen. Zusätzlich wird eine L-DNA-Doppelhelix als Trägermodul für das Chemotherapeutikum Doxorubicin (DOX) an das RNA-Gerüst angeheftet. DOX wird dabei zwischen die Basenpaare der L-DNA durch Interkalation eingelagert. Für die zielgerichtete Aufnahme in Tumorzellen wird das Nanopartikel darüber hinaus mit Folsäure funktionalisiert, um eine rezeptorvermittelte Aufnahme in Folatrezeptor-positive Tumorzellen zu ermöglichen.

In Zellversuchen zeigten die mit anti-MCL1-siRNA, DOX und Folsäure funktionalisierten Nanopartikel eine selektive Aufnahme in Folatrezeptor-positive Brustkrebszellen (MDA-MB-468), während in Folatrezeptor-negativen Zellen (HEK-293T) keine Aufnahme beobachtet wurde. Gleichzeitig führte die siRNA-vermittelte Hemmung von MCL1 zu einer Reduktion der MCL1-Proteinexpression. Durch die kombinierte Verabreichung von siRNA und DOX wurde ein synergistischer antiproliferativer Effekt erzielt, der das Tumorwachstum stärker hemmt als die jeweiligen Einzelkomponenten. Vergleichsstudien zeigten zudem eine geringere unspezifische Toxizität der L-RNA-basierten Nanopartikel im Vergleich zu D-RNA-basierten Partikeln.

Während bestimmte Aspekte der intrazellulären Wirkstofffreisetzung und Verarbeitung noch Gegenstand weiterer Untersuchungen sind, deuten die Ergebnisse insgesamt auf eine hohe funktionelle Leistungsfähigkeit der Plattform hin. Insgesamt zeigt die Studie, dass L-RNA-basierte Nanostrukturen eine vielversprechende Plattform für ein stabiles und flexibles System zur Abgabe von Therapeutika darstellen, das u. a. in der Krebstherapie eingesetzt werden kann. 

Werden verschiedene Organisatorzellen kombiniert (z. B. ein WNT3A-Knoten und eine DKK1-Schale), kann ein räumlicher WNT3A-Morphogengradient im Embryoid erzeugt werden, wodurch unterschiedliche Zelllinien innerhalb desselben Embryoids entstehen. Diese synthetischen Organisatoren können zur Untersuchung entwicklungsbiologischer Prozesse genutzt werden und könnten langfristig auch für die Erzeugung von Geweben oder Organen für klinische Anwendungen eingesetzt werden.

Incompatibility in cell adhesion constitutes a barrier to interspecies chimerism (Ballard et al. 2024)

Die Blastozystenkomplementierung ist eine Möglichkeit, dem Mangel an Spenderorganen für Personen, die eine Transplantation benötigen, zu begegnen. Zu diesem Zweck werden pluripotente Stammzellen (PSC) verwendet und einem tierischen Wirtsembryo injiziert, dessen Organogenese durch eine genetische Veränderung gestört ist, sodass er selbst das entsprechende Organ nicht ausbildet. Der Wirtsembryo nutzt dann die Spender-PSC, um das Organ zu bilden. Die Technik hat ihre Grenzen, wenn sie bei entfernt verwandten Arten wie Mäusen und Menschen angewandt wird, was auf xenogene Barrieren zurückzuführen ist. Eines dieser Hindernisse scheint die Inkompatibilität der Zelladhäsion zu sein. Während der Entwicklung werden die Epiblastzellen durch starke Verankerungsverbindungen zusammengehalten, und die Autoren stellten die Hypothese auf, dass nicht zusammenpassende Zelladhäsionsmoleküle die Integration humaner PSCs behindern könnten. Um die Zelladhäsion zu verbessern, setzten sie nanobodies ein, bei denen es sich um von Kameliden-Antikörpern abgeleitete Einzeldomänen-Fragmente handelt, die in vitro eine Interspezies-Adhäsion bewirken. Humane PSCs wurden so verändert, dass sie einen nanobody gegen GFP auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, und es konnte gezeigt werden, dass sie an murine embryonale Stammzellen binden. In vivo wurden die nanobodies-exprimierenden humanen induzierten PSCs in GFP-exprimierende Mausblastozysten injiziert und in Leihmütter übertragen. Es zeigte sich, dass die daraus resultierenden Embryonen mehr chimäre Zellen enthielten als Kontroll-Embryonen. Diese Technik könnte zur Weiterentwicklung der Interspezies-Organogenese eingesetzt werden.

An electrogenetic interface to program mammalian gene expression by direct current (Huang et al. 2023)

Die Autoren haben eine Schnittstelle entwickelt, um tragbare elektronische Geräte mit medizinischen Interventionen zu verbinden. Die Schnittstelle, die als direct current-actuated regulation technology (DART) bezeichnet wird, ermöglicht die Programmierung der Expression eines Fremdgens in menschlichen Zellen. Über Gleichstrom werden nicht-toxische Mengen reaktiver Sauerstoffspezies gebildet, die mit einem Biosensor, einem Protein namens KEAP1, interagieren. KEAP1 setzt den Transkriptionsfaktor NRF2 frei, der nun in den Zellkern wandert, dort an einen synthetischen Promotor bindet und so die NRF2-vermittelte reversible Expression eines bestimmten Gens bewirkt. Das System wurde in vivo getestet. Ein Batteriepack lieferte dabei Gleichstrom und war über einen manuellen Ein-/Aus-Schalter mit zwei speziell angefertigten Akupunkturnadeln verbunden, die an einer Implantationsstelle auf dem Rücken von Mäusen mit Typ-1-Diabetes angebracht wurden. An der Implantationsstelle befanden sich subkutan mikroverkapselte, gentechnisch veränderte menschliche Zellen, die natives KEAP1 und NRF2 exprimieren, sowie unter Kontrolle von NRF2 das Gen für Insulin exprimieren. DART senkte den hohen Blutzuckerspiegel der Typ-1-Diabetes-Mäuse durch Stimulierung der Insulinexpression. Die durch DART ermöglichte Verbindung von analogen biologischen Systemen mit digitalen elektronischen Geräten verspricht vielseitige Einsatzmöglichkeiten für gen- und zellbasierte Therapien, Echtzeit-Dosierungen und für die Fernüberwachung von Patienten durch medizinisches Personal.

Leveraging DNA-Encoded Cell-Mimics for Environment-Adaptive Transmembrane Channel Release-Induced Cell Death (Li et al. 2024)

Die Autoren haben ein künstliches DNA-kodiertes Modell (ARTC) entwickelt, das T-Zellen imitiert. Es ahmt die Funktion von zytotoxischen T-Lymphozyten nach, die eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf Tumore spielen, indem sie das Protein Perforin freisetzen, welches Membranporen verursacht und so die Homöostase der Zielzellen stört. ARTC besteht aus DNA-basierten kugelförmigen Partikeln, die einen doppelsträngigen DNA-Komplex (IG) mit drei funktionellen Bereichen enthalten: den m*-Bereich als Brückensequenz, das i-Motiv-DNA-Fragment für die Reaktion auf pH-Änderungen und LG4, ein Guanin-reicher DNA-Strang. Strukturelle Veränderungen in IG als Reaktion auf eine leicht saure Umgebung führen zur Freisetzung von LG4, die aus der DNA-Sphäre austritt und sich in der Zielzellmembran verankert, wodurch ein Kalium-Ionen-Kanal entsteht. Der darauffolgende Ausstrom von Kalium-Ionen stört die Zellhomöostase und löst schließlich die Apoptose der Zielzelle aus. Zellmimetika wie dieses sollen weiterentwickelt werden, um präzise und kontrollierte Behandlungen zur Wiederherstellung der Zellfunktion zu ermöglichen.

A Dueling-Competent Signal-Sensing Module Guides Precise Delivery of Cargo Proteins into Target Cells by Engineered Pseudomonas aeruginosa (Wu et al. 2023)Die Autoren entwickelten eine hochselektive Plattform für die Proteinabgabe, genannt DUEC (dueling competent), indem sie die Tit-for-Tat (“Wie du mir, so ich dir”) /Duell-Reaktion des H1-T6SS (Typ-VI-Sekretionssystem) in Pseudomonas aeruginosa nutzten. P. aeruginosa kann den genauen Ort des physischen Kontakts mit einem benachbarten Bakterium wahrnehmen, sich daran erinnern und eine Vergeltungsreaktion, bekannt als Schwesterzellduell oder Tit-for-Tat, gegen heterologe Angreifer einleiten. Diese einzigartige Reaktion bei P. aeruginosa wird durch T6SS vermittelt, das toxische Effektoren absondert, die Konkurrenten bei direktem Kontakt abtöten. Die Autoren verwendeten DUEC-Zellen, bei denen es sich um P. aeruginosa-Zellen handelt, denen die toxischen Effektoren fehlen, die aber in der Lage sind, H1-T6SS zu produzieren und sich an Duellen zu beteiligen. Die weiterentwickelten DUEC-Zellen waren in der Lage, eine Nuklease als Fracht auf diskriminierende Weise in das Cytosol von T6SS+, aber nicht T6SS-Vibrio cholerae-Zellen zu transportieren, um provokative Zellen in einer gemischten Gemeinschaft selektiv abzutöten. Es wurde auch eine Cre-Rekombinase als Fracht verwendet, was zeigt, dass DUEC-Zellen nicht nur eine prototypische Plattform für die Zellerkennung und Abgabe von Material an Zielzellen sind, sondern auch mit rekombinationsbasierten Schaltkreisen gekoppelt werden können, die das Potenzial für komplexe Aufgaben in gemischten mikrobiellen Gemeinschaften haben.

A DNA turbine powered by a transmembrane potential across a nanopore (Shi et al. 2024)
Die Autoren habe eine nanoskalige DNA-Origami-Turbine nach dem bottom up-Prinzip hergestellt, die unter physikalischen Bedingungen autonom arbeitet und Energie aus natürlicherweise reichlich vorhandenen elektrochemischen Potentialen in mechanische Arbeit umwandelt. Die Turbine enthält eine zentrale Achse mit drei Blättern, die in einer chiralen Konfiguration, entweder links- oder rechtshändig, angeordnet sind und hat eine Höhe von 24 oder 27 nm. Sie kann ein langes DNA-Bündel als hydrodynamische Last bewegen anhand einer anhaltenden Drehbewegung von bis zu 10 Umdrehungen s-1. Die Drehrichtung der DNA-Turbinen kann durch die Ionenstärke des Puffers gesteuert werden, die auf eine Änderung des elektrophoretischen Anisotropieverhältnisses mit der Salzkonzentration zurückzuführen sein könnte.

Periplasmic biomineralization for semi-artificial photosynthesis (Lin et al. 2023)
Halbleiterbasierte Biointerfaces werden in der Regel entweder auf der Oberfläche der Plasmamembran oder im Zytoplasma hergestellt. Hier haben die Autoren entdeckt, dass Halbleiter-Nanocluster-Präzipitate im periplasmatischen Raum von Gram-negativen Bakterien die chemische Produktion in Escherichia coli effizient solarbetrieben antreiben können. Sie schufen nanostrukturierte „Exoskelette“ und etablierten halbleiterbasierte Schnittstellen im Periplasma von E. coli. Insbesondere wurde die Bildung von Halbleiter-Nanoclustern aus CdS, einem der am meisten untersuchten optisch aktiven Materialien, durch einen H₂S-produzierenden nichtgenetischen Weg vermittelt. Darüber hinaus zeigten sie, dass diese in situ hergestellten Halbleiter-Nanocluster unter Lichtbedingungen in E. coli den Adenosintriphosphat (ATP)-Spiegel erhöhen und die Malatproduktion steigern können. Die Autoren zeigten, dass dieser Prozess der semi-künstlichen Photosynthese für den Bau eines kontinuierlichen Bioreaktors auf der Grundlage lebender Materialien für die Umwandlung mehrerer Elemente angewendet werden kann. Die Autoren schlagen vor, dass die periplasmatische Biosynthese durch die Nutzung der Kraft der Biomineralisation und deren Ausweitung auf andere Bakterienzellen ein enormes Potenzial für die Konstruktion von halbleiterbasierten Biohybriden bietet, die in der Umweltsanierung, der Herstellung lebender Bioreaktoren und der halb-künstlichen Photosynthese für die Bioproduktion und verschiedene nachhaltige Anwendungen eingesetzt werden können.

Sub-1.4 cm3 capsule for detecting labile inflammatory biomarkers in situ (Inda-Webb et al. 2023)
Transiente Moleküle im Magen-Darm-Trakt sind wichtige Signale und Vermittler von Entzündungen. Aufgrund ihrer hochreaktiven Natur und ihrer extrem kurzen Lebensdauer im Organismus sind diese Moleküle schwer nachzuweisen. Die Autoren entwickelten eine miniaturisierte, drahtlose, bioelektronische Pille, ein Gerät, das gentechnisch veränderte probiotische Biosensoren (lebende Bakterien) enthält, die auf entzündungsassoziierte Moleküle wie Stickstoffmonoxid, Wasserstoffperoxid, Tetrathionat und Thiosulfat mit Lumineszenz reagieren, kombiniert mit einem speziell entwickelten Fotodetektor und Ausleseschip, um die Moleküle im Gastrointestinaltrakt verfolgen zu können. Dies wird durch die Transkription einer Rekombinase als Reaktion auf den Signalbiomarker realisiert, die wiederum zur quantitativen Expression eines Lumineszenzgens führt. In das Gerät integrierte elektronische Ausleseschaltungen mit geringer Leistung wandeln das von den eingekapselten Bakterien emittierte Licht in ein drahtloses Signal um, das an ein Smartphone übertragen werden kann. Alle Komponenten wurden in eine Kapsel mit einem Volumen von weniger als 1,43 cm³ integriert, die zur Einnahme geeignet ist. Die Autoren demonstrierten die in vivo Biosensorüberwachung im Magen-Darm-Trakt von Mäusen und Schweinen. Mit diesem Gerät könnten Krankheiten wie entzündliche Darmerkrankungen früher als derzeit möglich diagnostiziert und der Krankheitsverlauf genauer verfolgt werden.

Cell-free biosynthesis combined with deep learning accelerates de novo-development of antimicrobial peptides (Pandi et al. 2023)Bioaktive Peptide sind Schlüsselmoleküle in der Gesundheit und Medizin, und Deep Learning ist eine vielversprechende Methode für ihre Entdeckung und Gestaltung. Die Autoren haben einen kostengünstigen Ansatz mit hohem Durchsatz entwickelt, um bioaktive Peptidkandidaten innerhalb von weniger als 24 Stunden zu identifizieren und zu validieren. Sie nutzten Deep Learning, um Tausende von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) de novo zu entwerfen. Mithilfe von Rechenmethoden wurden 500 Kandidaten ausgewählt, die sie mit ihrer neu eingerichteten CFPS-Pipeline schnell und kostengünstig direkt aus DNA-Vorlagen herstellten und untersuchten. Die neuen AMPs wurden an 20-µl-Bakterienzellkulturen im 384-Well-Format getestet und die optische Dichte wurde bei 600 nm gemessen. Die Autoren identifizierten 30 funktionelle AMPs, die sie anhand von Molekulardynamiksimulationen, antimikrobieller Aktivität und Toxizität weiter charakterisierten. Bemerkenswert ist, dass sechs de novo-AMPs eine Breitbandwirkung gegen multiresistente Krankheitserreger aufweisen und keine bakteriellen Resistenzen auslösen.

Für diesen Bereich wurden zwei Publikationen ausgewählt.
Ein synthetisches Transkriptionssystem steuert die Expressionsstärke eines gene of interest über verschiedene gRNAs, ihre komplementären Bindestellen sowie ein deaktiviertes CRISPR-Protein, welches an eine Aktivierungsdomäne fusioniert wurde. Dadurch ist eine präzise Expression über einen Bereich von mehr als 1000 Einheiten möglich (Chen et al. 2022). Ein oszillierender Schaltkreis, der über zwei inducer in E. coli gesteuert wird, kann sowohl seine Periode als auch seine Amplitude verändern und kann beispielsweise für eine pulsierende Verabreichung von Medikamenten verwendet werden (Zhang et al. 2022).